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摘 要 以木薯华南5号（SC5）和华南8号（SC8）微茎尖为外植体，通过比较试验，对微茎尖的长度、初始培养基、继代增殖和生根培养基进行筛选。结果表明：将长度为0.4～0.5 mm的木薯微茎尖外植体接种于初代培养基MS+6-BA 0.01 mg /L+NAA 0.02 mg /L+GA31.0 mg /L上培养30 d后，SC5和SC8成活率均达60.0%以上；初代培养的小苗在继代和生根培养基MS+NAA 0.02 mg /L上培养35 d后，SC5和SC8增值系数均达4.0以上，生根率达100%。建立了SC5和SC8木薯微茎尖离体培养技术体系，为下一步木薯脱毒培养奠定基础。
关键词 木薯；微茎尖；离体培养
中图分类号 S533 文献标识码 A
木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯属植物，起源于热带美洲，广泛栽培于热带和部分亚热带地区，是非洲地区重要的粮食作物，也是中国重要的加工淀粉和生物质能源作物。近年来，为推动中国木薯产业发展，丰富木薯种质资源的遗传多样性，国内相关的研究机构及企业等不断从国际热带农业中心（CIAT）和巴西国家农牧研究院（EMBRAPA）等国际组织和国外研究机构引进新的木薯种质。而新种质资源引进同时，也容易把一些病虫害尤其是检疫对象携带进国内，因此引进木薯种质的安全与健康极为重要。微茎尖培养已被广泛用于马铃薯[1]、甘薯[2]、甘蔗[3]、芭蕉[4]和黄冠梨[5]等作物的快繁体系建立和健康种苗生产。在国内外，相关学者们对木薯组织培养及快速繁殖技术进行了较多的研究，采用的外植体主要有分生组织[6]、腋芽[7-11]、嫩叶[12-20]、茎尖[20]和花[21]等，以微茎尖为外植体进行组织培养尚未见相关报道。本研究选用中国木薯主栽品种华南5号（SC5）和华南8号（SC8）的微茎尖为试验材料，对其初代培养基、微茎尖长度、增殖和生根培养基进行筛选，旨在建立木薯微茎尖离体培养技术体系，为下一步脱毒苗的培育和种质资源的安全保存等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
SC5和SC8试管苗由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所木薯组织培养实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 木薯微茎尖初代培养基的筛选 在解剖镜下剥取长度为0.4～0.5 mm、带1～2个叶原基的茎尖，接种到3种激素培养基上（以MS为基本培养基，分别添加3个不同质量浓度水平的NAA、6-BA、GA3，表1），考察不同激素种类和浓度组合对供试材料微茎尖初代培养成活率的影响。试验采用L9（34）正交设计，参试的9个处理组合（简称处理）见表2，每个处理培养基添加20 g/L蔗糖，pH值为5.8，培养基以121 ℃灭菌，培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每个处理接种20个外植体，重复3 次，30 d后统计成活率（以茎段伸长1节以上和长出1～2片新叶为标准）和观察生长情况，筛选出适合木薯微茎尖生长的初代培养基配方：
成活率/%=接种成活外植体数/接种外植体数×100
1.2.2 茎尖长度对木薯微茎尖培养的影响 选取SC5和SC8生长健壮的试管苗，在解剖显微镜下剥离带1～2个叶原基的茎尖，长度为0.2～0.3 mm和0.4～ 0.5 mm，接种到筛选出的最佳微茎尖初代培养基上，培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每个处理接种20个外植体，重复3次，30 d后统计成活率和观察生长情况，筛选出适合木薯微茎尖培养的茎尖长度。
1.2.3 继代增殖与生根培养 在经初代培养获得的小苗上切取长1.0～1.5 cm的顶芽或带有侧芽的茎段，接种于继代培养基上进行增殖和生根培养。培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h，每个处理接种20个外植体，重复3次，35 d后统计增殖系数、生根率和观察生长情况，筛选出适宜的微茎尖继代培养基配方。继代培养基为MS附加不同质量浓度的NAA、6-BA、GA3 3种激素，附加20 g/L蔗糖和6 g/L卡拉胶：
增殖系数=增殖的新顶芽和带侧芽茎段数/接种顶芽和带侧芽茎段数
生根率/%=生根的小苗数/接种小苗数×100
1.3 数据统计分析
采用SAS9.2软件进行数据统计分析，其中，成活率经反正弦转换后进行方差分析，多重比较采用Duncan测验法。
2 结果与分析
2.1 木薯微茎尖初代培养的形态变化
将长度为0.4～0.5 mm的SC8微茎尖接种到初代培养基7 d后，茎尖顶端开始突起，颜色变绿（图1-A）；14 d时茎尖长出长约4～7 mm的带绿色小叶的芽（图1-B）；30 d时茎尖伸长长成为2～4个节长的小苗，部分小苗长出1～2条根（图1-C）。SC5微茎尖初代培养的形态发育变化与SC8相似。
2.2 木薯微茎尖初代培养基的筛选
正交试验参试的9个处理的成活率观测及方差分析结果见表2。SC5和SC8微茎尖初代培养的9个处理的成活率差异分别达显著（F=2.74*）和极显著（F=7.94**）。SC5成活率最高的是处理5，达到68.3%，但节间细长，顶芽处断开脱落。SC8成活率最高的是处理9，达70.0%，但茎尖有膨大现象，根部有愈伤组织产生，不利于养分的吸收。
对各处理的成活率进行正交试验方差分析及Duncan测验，结果见表3。由3个因子的F值大小可知，对SC5和SC8微茎尖初代培养成活率影响的大小依次均为：GA3>NAA>6-BA，即GA3的影响最大，水平间成活率达极显著；NAA和6-BA的影响不大，均未达显著水平。GA3 1.00 mg/L和3.00 mg/L水平的成活率均极显著高于0.1 mg/L的成活率，而两者间成活率差异不显著。 可见，不同浓度NAA和6-BA对SC5和SC8微茎尖初代培养成活率的影响不大，当NAA浓度达0.04 mg/L，伤口处易产生愈伤组织，不利于营养吸收，影响后续生长。GA3不同浓度间的成活率差异达到极显著水平；随着GA3的浓度从0.1 mg/L增加到1.0 mg/L，节间生长速率加快，成苗率显著提高；当GA3浓度达最高即3.0 mg/L时，节间变得细长，且易从顶芽处断开，导致顶芽脱落。
根据方差结果和出于经济角度考虑，得出0.01 mg/L NAA、0.01 mg/L 6-BA和1.00 mg/L GA3是SC5和SC8微茎尖初代培养最优的培养基配方，但这个处理不在L9（34）正交设计中。为此，将经方差分析设计得出的最优处理和L9（34）处理4进行了验证试验，结果显示成活率差异不显著；结合生长情况，发现外植体的萌动L9（34）处理4较方差分析的最优处理提前3～5 d，得出MS+0.02 mg/L NAA+0.01 mg/L 6-BA+1.0 mg/L GA3是试验的最佳微茎尖初代培养基配方。
2.3 茎尖长度对茎尖培养成活率的影响
从表4可知，不同的茎尖长度对SC5和SC8的茎尖成苗率有显著影响。当茎尖长度为0.2～0.3 mm时，SC5和SC8茎尖成苗率很低，分别为8.9%和11.0%；茎尖长度为0.4～0.5 mm，SC5和SC8茎尖成苗率增加到64.0%和66.8%。由此可见，茎尖越短，成活率越低；茎尖越长，成活率越高。
2.4 微茎尖继代增殖和生根培养
将微茎尖初代培养获得的小苗接种到继代培养基上，培养35 d后小苗长出新根，其增殖和生根培养在同一培养基中进行。由于茎尖初代培养的小苗比较幼嫩，为方便操作和减少损伤，第1次继代培养接种于培养皿中（图2-A），第2次继代培养接入试管或培养瓶中（图2-B）。
不同浓度激素配比对SC5和SC8微茎尖继代培养增值系数和生根率的影响差异均不显著（表5）。各处理的小苗均长势良好，长出2～4条不定根，生根率达100%。其中处理1植株健壮，SC5增殖系数为4.18，SC8增殖系数4.19；处理2小苗生长节间明显加长；处理3小苗初期生长速率较快，但根基部易产生愈伤，不利于后期营养吸收。
综合考虑生长情况和经济问题，认为MS+0.02 mg/L NAA是最佳微茎尖继代培养基配方。
3 讨论与结论
以微茎尖外植体进行离体培养是获得茎尖脱毒种苗的一个关键技术。在进行微茎尖外植体离体培养时，植物生长调节剂的种类与浓度配比是关键因子。细胞分裂素与生长素的比值影响芽和根的分化[22]。据甘专等[23]报道，细胞分裂素在毛葡萄微茎尖离体培养的增殖与生根过程中起主导作用。赵福永[24]在研究棉花茎尖离体培养中发现，0.10 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA是棉花茎尖生长的最佳条件。本研究中，0.01 mg/L 6-BA和0.02 mg/L NAA 有利于SC5和SC8的茎尖培养。在植物茎尖培养中，许多研究者都通过添加GA3来促进茎尖的萌发和伸长，提高茎尖培养成苗率[25]，这与本研究结果一致。本研究中，1.0 mg/L GA3是 SC5和SC8微茎尖培养的适宜浓度，这与Kartha等[26]报道（GA3适宜浓度为0.03 mg/L）的结果不符，这可能与不同材料的遗传特性有关。
微茎尖长度是影响成活率的重要因素，一般来说，茎尖越长，成苗率越高。何欢乐等[27]发现取草莓茎尖长度为0.3～0.5 mm，成活率较高；曹冬煦等[28]在进行“巨峰”葡萄茎尖培养时也选取0.5 mm的茎尖。本研究发现切取的木薯茎尖长度为0.2～0.3 mm 时，成活率很低且操作难度大；而选取0.4～0.5 mm长的茎尖时成活率大大提高。
本研究中，木薯微茎尖仅经初代培养即能一步获得完整的植株，只需切取顶芽和带侧芽的茎段进行继代培养即可进行快速扩繁，该方法简单，缩短了培养周期，但初代培养的成活率仅在60.0%左右，有待提高。以微茎尖为外植体的离体培养已成为最常用、经济有效的脱毒方法，建立木薯微茎尖离体培养体系可为木薯健康种苗培育和种质资源保存提供技术参考。
参考文献
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关键词 木薯；微茎尖；离体培养
中图分类号 S533 文献标识码 A
木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯属植物，起源于热带美洲，广泛栽培于热带和部分亚热带地区，是非洲地区重要的粮食作物，也是中国重要的加工淀粉和生物质能源作物。近年来，为推动中国木薯产业发展，丰富木薯种质资源的遗传多样性，国内相关的研究机构及企业等不断从国际热带农业中心（CIAT）和巴西国家农牧研究院（EMBRAPA）等国际组织和国外研究机构引进新的木薯种质。而新种质资源引进同时，也容易把一些病虫害尤其是检疫对象携带进国内，因此引进木薯种质的安全与健康极为重要。微茎尖培养已被广泛用于马铃薯[1]、甘薯[2]、甘蔗[3]、芭蕉[4]和黄冠梨[5]等作物的快繁体系建立和健康种苗生产。在国内外，相关学者们对木薯组织培养及快速繁殖技术进行了较多的研究，采用的外植体主要有分生组织[6]、腋芽[7-11]、嫩叶[12-20]、茎尖[20]和花[21]等，以微茎尖为外植体进行组织培养尚未见相关报道。本研究选用中国木薯主栽品种华南5号（SC5）和华南8号（SC8）的微茎尖为试验材料，对其初代培养基、微茎尖长度、增殖和生根培养基进行筛选，旨在建立木薯微茎尖离体培养技术体系，为下一步脱毒苗的培育和种质资源的安全保存等奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
SC5和SC8试管苗由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所木薯组织培养实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 木薯微茎尖初代培养基的筛选 在解剖镜下剥取长度为0.4～0.5 mm、带1～2个叶原基的茎尖，接种到3种激素培养基上（以MS为基本培养基，分别添加3个不同质量浓度水平的NAA、6-BA、GA3，表1），考察不同激素种类和浓度组合对供试材料微茎尖初代培养成活率的影响。试验采用L9（34）正交设计，参试的9个处理组合（简称处理）见表2，每个处理培养基添加20 g/L蔗糖，pH值为5.8，培养基以121 ℃灭菌，培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每个处理接种20个外植体，重复3 次，30 d后统计成活率（以茎段伸长1节以上和长出1～2片新叶为标准）和观察生长情况，筛选出适合木薯微茎尖生长的初代培养基配方：
成活率/%=接种成活外植体数/接种外植体数×100
1.2.2 茎尖长度对木薯微茎尖培养的影响 选取SC5和SC8生长健壮的试管苗，在解剖显微镜下剥离带1～2个叶原基的茎尖，长度为0.2～0.3 mm和0.4～ 0.5 mm，接种到筛选出的最佳微茎尖初代培养基上，培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h。每个处理接种20个外植体，重复3次，30 d后统计成活率和观察生长情况，筛选出适合木薯微茎尖培养的茎尖长度。
1.2.3 继代增殖与生根培养 在经初代培养获得的小苗上切取长1.0～1.5 cm的顶芽或带有侧芽的茎段，接种于继代培养基上进行增殖和生根培养。培养温度（26±2）℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h/12 h，每个处理接种20个外植体，重复3次，35 d后统计增殖系数、生根率和观察生长情况，筛选出适宜的微茎尖继代培养基配方。继代培养基为MS附加不同质量浓度的NAA、6-BA、GA3 3种激素，附加20 g/L蔗糖和6 g/L卡拉胶：
增殖系数=增殖的新顶芽和带侧芽茎段数/接种顶芽和带侧芽茎段数
生根率/%=生根的小苗数/接种小苗数×100
1.3 数据统计分析
采用SAS9.2软件进行数据统计分析，其中，成活率经反正弦转换后进行方差分析，多重比较采用Duncan测验法。
2 结果与分析
2.1 木薯微茎尖初代培养的形态变化
将长度为0.4～0.5 mm的SC8微茎尖接种到初代培养基7 d后，茎尖顶端开始突起，颜色变绿（图1-A）；14 d时茎尖长出长约4～7 mm的带绿色小叶的芽（图1-B）；30 d时茎尖伸长长成为2～4个节长的小苗，部分小苗长出1～2条根（图1-C）。SC5微茎尖初代培养的形态发育变化与SC8相似。
2.2 木薯微茎尖初代培养基的筛选
正交试验参试的9个处理的成活率观测及方差分析结果见表2。SC5和SC8微茎尖初代培养的9个处理的成活率差异分别达显著（F=2.74*）和极显著（F=7.94**）。SC5成活率最高的是处理5，达到68.3%，但节间细长，顶芽处断开脱落。SC8成活率最高的是处理9，达70.0%，但茎尖有膨大现象，根部有愈伤组织产生，不利于养分的吸收。
对各处理的成活率进行正交试验方差分析及Duncan测验，结果见表3。由3个因子的F值大小可知，对SC5和SC8微茎尖初代培养成活率影响的大小依次均为：GA3>NAA>6-BA，即GA3的影响最大，水平间成活率达极显著；NAA和6-BA的影响不大，均未达显著水平。GA3 1.00 mg/L和3.00 mg/L水平的成活率均极显著高于0.1 mg/L的成活率，而两者间成活率差异不显著。 可见，不同浓度NAA和6-BA对SC5和SC8微茎尖初代培养成活率的影响不大，当NAA浓度达0.04 mg/L，伤口处易产生愈伤组织，不利于营养吸收，影响后续生长。GA3不同浓度间的成活率差异达到极显著水平；随着GA3的浓度从0.1 mg/L增加到1.0 mg/L，节间生长速率加快，成苗率显著提高；当GA3浓度达最高即3.0 mg/L时，节间变得细长，且易从顶芽处断开，导致顶芽脱落。
根据方差结果和出于经济角度考虑，得出0.01 mg/L NAA、0.01 mg/L 6-BA和1.00 mg/L GA3是SC5和SC8微茎尖初代培养最优的培养基配方，但这个处理不在L9（34）正交设计中。为此，将经方差分析设计得出的最优处理和L9（34）处理4进行了验证试验，结果显示成活率差异不显著；结合生长情况，发现外植体的萌动L9（34）处理4较方差分析的最优处理提前3～5 d，得出MS+0.02 mg/L NAA+0.01 mg/L 6-BA+1.0 mg/L GA3是试验的最佳微茎尖初代培养基配方。
2.3 茎尖长度对茎尖培养成活率的影响
从表4可知，不同的茎尖长度对SC5和SC8的茎尖成苗率有显著影响。当茎尖长度为0.2～0.3 mm时，SC5和SC8茎尖成苗率很低，分别为8.9%和11.0%；茎尖长度为0.4～0.5 mm，SC5和SC8茎尖成苗率增加到64.0%和66.8%。由此可见，茎尖越短，成活率越低；茎尖越长，成活率越高。
2.4 微茎尖继代增殖和生根培养
将微茎尖初代培养获得的小苗接种到继代培养基上，培养35 d后小苗长出新根，其增殖和生根培养在同一培养基中进行。由于茎尖初代培养的小苗比较幼嫩，为方便操作和减少损伤，第1次继代培养接种于培养皿中（图2-A），第2次继代培养接入试管或培养瓶中（图2-B）。
不同浓度激素配比对SC5和SC8微茎尖继代培养增值系数和生根率的影响差异均不显著（表5）。各处理的小苗均长势良好，长出2～4条不定根，生根率达100%。其中处理1植株健壮，SC5增殖系数为4.18，SC8增殖系数4.19；处理2小苗生长节间明显加长；处理3小苗初期生长速率较快，但根基部易产生愈伤，不利于后期营养吸收。
综合考虑生长情况和经济问题，认为MS+0.02 mg/L NAA是最佳微茎尖继代培养基配方。
3 讨论与结论
以微茎尖外植体进行离体培养是获得茎尖脱毒种苗的一个关键技术。在进行微茎尖外植体离体培养时，植物生长调节剂的种类与浓度配比是关键因子。细胞分裂素与生长素的比值影响芽和根的分化[22]。据甘专等[23]报道，细胞分裂素在毛葡萄微茎尖离体培养的增殖与生根过程中起主导作用。赵福永[24]在研究棉花茎尖离体培养中发现，0.10 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA是棉花茎尖生长的最佳条件。本研究中，0.01 mg/L 6-BA和0.02 mg/L NAA 有利于SC5和SC8的茎尖培养。在植物茎尖培养中，许多研究者都通过添加GA3来促进茎尖的萌发和伸长，提高茎尖培养成苗率[25]，这与本研究结果一致。本研究中，1.0 mg/L GA3是 SC5和SC8微茎尖培养的适宜浓度，这与Kartha等[26]报道（GA3适宜浓度为0.03 mg/L）的结果不符，这可能与不同材料的遗传特性有关。
微茎尖长度是影响成活率的重要因素，一般来说，茎尖越长，成苗率越高。何欢乐等[27]发现取草莓茎尖长度为0.3～0.5 mm，成活率较高；曹冬煦等[28]在进行“巨峰”葡萄茎尖培养时也选取0.5 mm的茎尖。本研究发现切取的木薯茎尖长度为0.2～0.3 mm 时，成活率很低且操作难度大；而选取0.4～0.5 mm长的茎尖时成活率大大提高。
本研究中，木薯微茎尖仅经初代培养即能一步获得完整的植株，只需切取顶芽和带侧芽的茎段进行继代培养即可进行快速扩繁，该方法简单，缩短了培养周期，但初代培养的成活率仅在60.0%左右，有待提高。以微茎尖为外植体的离体培养已成为最常用、经济有效的脱毒方法，建立木薯微茎尖离体培养体系可为木薯健康种苗培育和种质资源保存提供技术参考。
参考文献
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