【摘 要】
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目的 克隆并构建葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)启动子的荧光素酶报告基因载体并检测其活性.方法 以ZR75-1细胞提取的基因组为模板进行PCR扩增,将获得的GLUT1启动子片段酶切后连接至
【机 构】
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山西医科大学,太原 030000;解放军总医院第四医学中心,北京 100048;军事科学院军事医学研究院生物工程研究所,北京 100850;贵州大学医学院,贵阳 550025;中部战区总医院卫勤部科训
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目的 克隆并构建葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)启动子的荧光素酶报告基因载体并检测其活性.方法 以ZR75-1细胞提取的基因组为模板进行PCR扩增,将获得的GLUT1启动子片段酶切后连接至荧光素酶报告载体pGL4-basic中,重组质粒pGL4-basic-GLUT1经测序正确后与空载体分别转染293T细胞,并检测启动子活性;再将pGL4-basic-GLUT1同myc-HIF1α或对照质粒pXJ-40-myc转染ZR75-1细胞,分别在高糖和低糖条件下培养,检测启动子活性,探讨低氧诱导因子1α(HIF1α)对GLUT1启动子活性的影响.结果 DNA测序显示,扩增片段与GLUT1启动子片段的序列一致.荧光素酶活性实验显示,转染pGL4-basic-GLUT1后,GLUT1启动子较对照组有较高活性(P<0.001);低糖条件下,pGL4-basic-GLUT1与myc-HIF1α共转染,GLUT1启动子活性更强(P=0.042).结论 成功构建了GLUT1启动子报告基因载体,明确了HIF1α在高糖和低糖条件下对GLUT1启动子活性的增强作用,为深入研究GLUT1在肿瘤细胞代谢中的作用奠定了基础.
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