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摘要 [目的]研究披针叶黄华生物碱的具体种类及含量。[方法]采用生物碱系统提取、硅胶柱层析分离及重结晶技术从披针叶黄华干草粉中分离生物碱，并用GC-MS对总碱和结晶进行测定。[结果]分离出2种生物碱结晶Ⅰ和结晶Ⅱ，总碱中含有7种喹诺里西啶生物碱，结晶Ⅰ为黄华碱，结晶Ⅱ为Tetrahydrodeoxoargentamin。[结论]该试验为进一步研究披针叶黄华动物中毒的毒性毒理提供了理论依据。
关键词 披针叶黄华;生物碱;成分分析
中图分类号 S567 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）33-11660-02
Analysis on the Contents of Alkaloid in Thermopsis lanceolate
LIN Yuan1， WANG Zhi-sheng1， LI Yong2，HE Sheng-hu3* et al
（1. Ningxia Medical University， Yinchuan，Ningxia 750021; 2. Ningxia Polytechnic，Yinchuan，Ningxia 750021; 3.Ningxia University， Yinchuan，Ningxia 750021）
Abstract [Objective] The research aimed to study the specific types and contents of alkaloids in Thermopsis lanceolate. [Method]Alkaloid crystal was isolated from Thermopsis lanceolate powder by silica gel column and recrystal technology. The total alkaloids and crystallization were further determined by GC-MS. [Result]Two kinds alkaloid of crystalline Ⅰ and crystalline Ⅱ were isolated.The total alkaloids containing 7 kinds Kui Nuolixi Ding alkaloid， that crystal I is d-Thermopsine and crystal II is Tetrahydrodeoxoargentamin. [Conclusion] This experiment provides the theoretical basis for funther research on toxicity and toxicology of Thermopsis lanceolate-poisoning animal.
Key words Thermopsis lanceolate;Alkaloid;Contents analysis
作者简介 林源（1982- ），男，宁夏银川人，讲师，博士，从事天然药物及基因工程药物研究。*通讯作者，教授，硕士，博士生导师，从事家畜内科学疾病和有毒植物研究。
收稿日期 2014-10-17
披针叶黄华（Thermopsis lanceolate），又称牧马豆或土马豆，属豆科野决明属，多年生草本植物。分布于我国的东北、华北、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆、四川等省区，俄罗斯、蒙古也有分布。本种即是一种有毒植物[1]，牲畜误食种子或全草后会引起中毒;但其可作为一种药用植物，具有兴奋呼吸、抗辐射及祛痰止咳等功效。引起披针叶黄华中毒的成分主要是喹诺里西啶生物碱类，已报道的有黄花碱、臭豆碱、金雀花碱、d-鹰爪豆碱、羽扇豆碱、N-甲基金雀花碱、N-甲醛基金雀花碱等，该类生物碱具有抗癌、抗心率失调、抗微生物、抗溃疡和升高白细胞等多方面的药理作用[2]，具有潜在的药用价值。笔者在此采用生物碱系统提取、硅胶柱层析分离及重结晶技术从披针叶黄华干草粉中分离生物碱，并用GC-MS对总碱和结晶进行测定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料。
披针叶黄华于2006年10月采自宁夏盐池县，洗净、晒干、粉碎后备用。黄华碱、金雀花碱标准品购自上海融禾醫药科技发展有限公司，规格为20 mg。
1.1.2 主要仪器。
岛津GC-MSQP2010气质联用分析仪，美国惠普公司;AR1140电子天平，美国制造; 2XZ-2旋片式真空泵，浙江黄岩求精真空泵厂生产;RE52-05型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;Db-2型不锈钢电热板，苏州威尔实验用品有限公司。
1.1.3 试剂。薄层层析硅胶GF254，青岛海洋化工有限公司;柱层层析用硅胶，批号01284304，青岛海洋化工厂分厂。所用试剂和药品均为国产分析纯和AR级。
1.2 试验方法
1.2.1 披针叶黄华总碱的提取。
85%酒精加热回流提取，浓缩提取液得浸膏。用1N HCl溶解后氯仿除杂，氨水碱化至pH为9～11后氯仿萃取[3-4]。
1.2.2 总碱的薄层层析。
总生物碱、黄华碱、金雀花碱用甲醇溶解，再用毛细管点样于硅胶板上，乙酸乙脂-甲醇做展开剂，上行法展开[5]。展开剂跑至距硅胶板前沿1～2 cm处时取出，挥干溶剂。置于 254 nm紫外灯下观察荧光，再用改良碘化铋钾试剂喷雾显色，计算各点比移值（Rf）值。
1.2.3 总碱的柱层析分离。
称取15 g总碱，用甲醇溶解后与柱层析硅胶按1∶1（g/g）进行拌样，将拌好的样品挥干，研细备用。用石油醚装柱，采用湿法装柱、干法上样方法将处理好的样品上于硅胶柱[6-7]。洗脱液选用乙酸乙脂-甲醇系统梯度洗脱，梯度顺序为乙酸乙脂→乙酸乙脂∶甲醇（12∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶2）→甲醇。每15 ml收集1份。乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展开剂进行TLC检测，合并相同组分，待其自然挥干，收集管壁析出晶体，并重结晶进行纯化。 1.2.4 气相-质谱（Gas chromatograph-Mass spectrum，GC-MS）分析。对标准品、提取的总碱、结晶Ⅰ、结晶Ⅱ进行GC-MS分析[8]。各样品用甲醇溶解，进样量1 μl。
1.2.4.1 色谱条件。采用GC-MSQP2010气质联用分析仪，GC-MS接口温度280 ℃，检索谱库为DB-5MX。
1.2.4.2 GC条件。色谱柱HP-SE-54石英玻璃毛细管柱（甲基硅氧烷，0.25 mm×30 m），载气He，分流比20∶1，柱温190～280 ℃，程序升温5 ℃/min，进样口温度250 ℃，用峰面积归一法计算各化合物的相对百分含量。
1.2.4.3 MS条件。EI离子源，电子能量70 ev，离子源温度230 ℃，倍增器电压0.7 kV，质量扫描范围40～400 u，扫描周期0.5 s。DB-5MX质谱数据库检索，分析结果。
2 结果与分析
2.1 披针叶黄华生物碱提取结果
对5组提取试验的结果进行统计学分析，计算得出乙醇提取浸膏量为93.4 g/kg，总生物碱量为3.82 g/kg，披针叶黄华中生物碱的提取率平均为0.38%。
2.2 总生物碱薄层层析检查结果
总生物碱薄层层析以乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展开剂分离效果最好，可以看到8个点，其中5个点清晰明显且比较集中，2个点模糊。根据薄层层析结果（表1）判定披针叶黄华生物碱至少含有5种以上不同生物碱。
表1 总生物碱薄层层析检查结果
注：*表示该点不明显。
2.3 总碱柱层析分离结果
共收集244管洗脱液，经TLC检测合并Rf相同的试管。13～24管管壁有淡黄色片状结晶，试管底部为褐色油状物和结晶混合物，TLC检测出现3点;187～223管管壁有大量长丝状黄色结晶、TLC检测出现1点。共收获2种结晶，命名为结晶Ⅰ和结晶Ⅱ，结晶Ⅰ经甲醇重结晶后为淡黃色片装结晶，结晶Ⅱ经丙酮重结晶为针状淡黄色结晶。
2.4 GC-MS检测结果
总碱经GC-MS分析，共出峰24个，总离子流色谱图如图1所示，经质谱数据库检索，确定了7种生物碱成分（表2）。在总碱中首次测得了生物碱Tetrahydrodeoxoargentamin ，其余6种生物碱已见于以往的报道。总生物碱总离子流色谱图结果（图1）显示，总碱中5号和6
号生物碱的出峰时间与金雀花碱和黄华碱标准品的出峰时
图1 总生物碱总离子流色谱图
表2 披针叶黄华总碱GC-MS分析鉴定结果
间一致;而结晶I的出峰时间
与黄华碱相同、结晶Ⅱ出峰时间与金雀花碱标准品不同。
结晶Ⅰ经GC-MS检测并与标准品进行比对鉴定为黄华碱，纯度达96%;结晶Ⅱ经GC-MS检测为Tetrahydrodeoxoargentamin，纯度达70%，需进一步与标准品进行比对后确定。总碱中金雀花碱含量很少，仅为0.3%。
3 结论与讨论
（1）宁夏中草药手册记载该植物含生物碱量为0.5%～3.0%，其中茎叶0.79%、根0.76%、种子和花含量较高，分别为2.02%和1.46%。该试验采用醇类溶剂提取法提取披针叶黄华总生物碱，由于原料采用的是全草且采时已过开花时期，故草粉中生物碱含量低，提取总碱量仅占全草质量的0.38%。另一个原因是由于披针叶黄华中以大极性生物碱为主，故采用氯仿未能完全萃取出所含生物碱，应该继续用正丁醇提取残留生物碱。
（2）总碱薄层层析时，乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）分离效果最好，在碘化铋钾显色剂下呈现8个点。但在GC-MS分析中，仪器所检测并确定的物质只有7种，含量最小的生物碱仅占总碱的0.3%。因为气质联用仪精密度很高，故推测薄层层析中显色模糊的点有可能是其他生物碱的脱尾。
（3）经质谱数据库检索，确定的7种生物碱，有6种均为已知的披针叶黄华生物碱[9]，而Tetrahydrodeoxoargentamin未见报道存在于该植物当中，需进一步通过红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振（NMR）来鉴定其化学结构。以往报道披针叶黄华含量最高的是金雀花碱，约占总碱含量的40%左右[7-8]，而该试验中测得的金雀花碱仅占总碱的0.3%，可能是受植物采摘季节、提取部位以及提取分离方法等因素的影响。
参考文献
[1]陈翼胜，郑硕.中国有毒植物[M].北京：科学出版社，1987：265-267.
[2] 高文运，李医明，蒋山好，等.牧马豆生物碱成分研究[J].天然产物研究与开发，1999，11（2）：1-4.
[3] 赵宝玉，阮娜，何生虎，等.牧马豆中生物碱的提取分离及鉴定[J].动物医学进展，2003，24（4）：87-89.
[4] 林源.披针叶黄华生物碱的成分分析及其生物活性的实验研究[D].银川：宁夏大学， 2008.
[5] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第四卷）[M].上海：上海科学技术出版社，1996：385-388.
[6] 李扬汉.中国杂草志[M].北京：中国农业出版社，1998：285-288.
[7] 赵宝玉，张靖飞，哈斯巴图，等.披针叶黄华生物碱成分研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2002（3）：9-12.
[8] 周云凤，朱忠珂，赵宝玉.披针叶黄华的营养成分及生物碱成分分析[J].动物医学进展，2001（2）：415-418.
[9] 史志诚.动物毒物学[M].北京：中国农业出版社，2001.
关键词 披针叶黄华;生物碱;成分分析
中图分类号 S567 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2014）33-11660-02
Analysis on the Contents of Alkaloid in Thermopsis lanceolate
LIN Yuan1， WANG Zhi-sheng1， LI Yong2，HE Sheng-hu3* et al
（1. Ningxia Medical University， Yinchuan，Ningxia 750021; 2. Ningxia Polytechnic，Yinchuan，Ningxia 750021; 3.Ningxia University， Yinchuan，Ningxia 750021）
Abstract [Objective] The research aimed to study the specific types and contents of alkaloids in Thermopsis lanceolate. [Method]Alkaloid crystal was isolated from Thermopsis lanceolate powder by silica gel column and recrystal technology. The total alkaloids and crystallization were further determined by GC-MS. [Result]Two kinds alkaloid of crystalline Ⅰ and crystalline Ⅱ were isolated.The total alkaloids containing 7 kinds Kui Nuolixi Ding alkaloid， that crystal I is d-Thermopsine and crystal II is Tetrahydrodeoxoargentamin. [Conclusion] This experiment provides the theoretical basis for funther research on toxicity and toxicology of Thermopsis lanceolate-poisoning animal.
Key words Thermopsis lanceolate;Alkaloid;Contents analysis
作者简介 林源（1982- ），男，宁夏银川人，讲师，博士，从事天然药物及基因工程药物研究。*通讯作者，教授，硕士，博士生导师，从事家畜内科学疾病和有毒植物研究。
收稿日期 2014-10-17
披针叶黄华（Thermopsis lanceolate），又称牧马豆或土马豆，属豆科野决明属，多年生草本植物。分布于我国的东北、华北、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆、四川等省区，俄罗斯、蒙古也有分布。本种即是一种有毒植物[1]，牲畜误食种子或全草后会引起中毒;但其可作为一种药用植物，具有兴奋呼吸、抗辐射及祛痰止咳等功效。引起披针叶黄华中毒的成分主要是喹诺里西啶生物碱类，已报道的有黄花碱、臭豆碱、金雀花碱、d-鹰爪豆碱、羽扇豆碱、N-甲基金雀花碱、N-甲醛基金雀花碱等，该类生物碱具有抗癌、抗心率失调、抗微生物、抗溃疡和升高白细胞等多方面的药理作用[2]，具有潜在的药用价值。笔者在此采用生物碱系统提取、硅胶柱层析分离及重结晶技术从披针叶黄华干草粉中分离生物碱，并用GC-MS对总碱和结晶进行测定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料。
披针叶黄华于2006年10月采自宁夏盐池县，洗净、晒干、粉碎后备用。黄华碱、金雀花碱标准品购自上海融禾醫药科技发展有限公司，规格为20 mg。
1.1.2 主要仪器。
岛津GC-MSQP2010气质联用分析仪，美国惠普公司;AR1140电子天平，美国制造; 2XZ-2旋片式真空泵，浙江黄岩求精真空泵厂生产;RE52-05型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;Db-2型不锈钢电热板，苏州威尔实验用品有限公司。
1.1.3 试剂。薄层层析硅胶GF254，青岛海洋化工有限公司;柱层层析用硅胶，批号01284304，青岛海洋化工厂分厂。所用试剂和药品均为国产分析纯和AR级。
1.2 试验方法
1.2.1 披针叶黄华总碱的提取。
85%酒精加热回流提取，浓缩提取液得浸膏。用1N HCl溶解后氯仿除杂，氨水碱化至pH为9～11后氯仿萃取[3-4]。
1.2.2 总碱的薄层层析。
总生物碱、黄华碱、金雀花碱用甲醇溶解，再用毛细管点样于硅胶板上，乙酸乙脂-甲醇做展开剂，上行法展开[5]。展开剂跑至距硅胶板前沿1～2 cm处时取出，挥干溶剂。置于 254 nm紫外灯下观察荧光，再用改良碘化铋钾试剂喷雾显色，计算各点比移值（Rf）值。
1.2.3 总碱的柱层析分离。
称取15 g总碱，用甲醇溶解后与柱层析硅胶按1∶1（g/g）进行拌样，将拌好的样品挥干，研细备用。用石油醚装柱，采用湿法装柱、干法上样方法将处理好的样品上于硅胶柱[6-7]。洗脱液选用乙酸乙脂-甲醇系统梯度洗脱，梯度顺序为乙酸乙脂→乙酸乙脂∶甲醇（12∶1、6∶1、3∶1、1∶1、1∶2）→甲醇。每15 ml收集1份。乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展开剂进行TLC检测，合并相同组分，待其自然挥干，收集管壁析出晶体，并重结晶进行纯化。 1.2.4 气相-质谱（Gas chromatograph-Mass spectrum，GC-MS）分析。对标准品、提取的总碱、结晶Ⅰ、结晶Ⅱ进行GC-MS分析[8]。各样品用甲醇溶解，进样量1 μl。
1.2.4.1 色谱条件。采用GC-MSQP2010气质联用分析仪，GC-MS接口温度280 ℃，检索谱库为DB-5MX。
1.2.4.2 GC条件。色谱柱HP-SE-54石英玻璃毛细管柱（甲基硅氧烷，0.25 mm×30 m），载气He，分流比20∶1，柱温190～280 ℃，程序升温5 ℃/min，进样口温度250 ℃，用峰面积归一法计算各化合物的相对百分含量。
1.2.4.3 MS条件。EI离子源，电子能量70 ev，离子源温度230 ℃，倍增器电压0.7 kV，质量扫描范围40～400 u，扫描周期0.5 s。DB-5MX质谱数据库检索，分析结果。
2 结果与分析
2.1 披针叶黄华生物碱提取结果
对5组提取试验的结果进行统计学分析，计算得出乙醇提取浸膏量为93.4 g/kg，总生物碱量为3.82 g/kg，披针叶黄华中生物碱的提取率平均为0.38%。
2.2 总生物碱薄层层析检查结果
总生物碱薄层层析以乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）做展开剂分离效果最好，可以看到8个点，其中5个点清晰明显且比较集中，2个点模糊。根据薄层层析结果（表1）判定披针叶黄华生物碱至少含有5种以上不同生物碱。
表1 总生物碱薄层层析检查结果
注：*表示该点不明显。
2.3 总碱柱层析分离结果
共收集244管洗脱液，经TLC检测合并Rf相同的试管。13～24管管壁有淡黄色片状结晶，试管底部为褐色油状物和结晶混合物，TLC检测出现3点;187～223管管壁有大量长丝状黄色结晶、TLC检测出现1点。共收获2种结晶，命名为结晶Ⅰ和结晶Ⅱ，结晶Ⅰ经甲醇重结晶后为淡黃色片装结晶，结晶Ⅱ经丙酮重结晶为针状淡黄色结晶。
2.4 GC-MS检测结果
总碱经GC-MS分析，共出峰24个，总离子流色谱图如图1所示，经质谱数据库检索，确定了7种生物碱成分（表2）。在总碱中首次测得了生物碱Tetrahydrodeoxoargentamin ，其余6种生物碱已见于以往的报道。总生物碱总离子流色谱图结果（图1）显示，总碱中5号和6
号生物碱的出峰时间与金雀花碱和黄华碱标准品的出峰时
图1 总生物碱总离子流色谱图
表2 披针叶黄华总碱GC-MS分析鉴定结果
间一致;而结晶I的出峰时间
与黄华碱相同、结晶Ⅱ出峰时间与金雀花碱标准品不同。
结晶Ⅰ经GC-MS检测并与标准品进行比对鉴定为黄华碱，纯度达96%;结晶Ⅱ经GC-MS检测为Tetrahydrodeoxoargentamin，纯度达70%，需进一步与标准品进行比对后确定。总碱中金雀花碱含量很少，仅为0.3%。
3 结论与讨论
（1）宁夏中草药手册记载该植物含生物碱量为0.5%～3.0%，其中茎叶0.79%、根0.76%、种子和花含量较高，分别为2.02%和1.46%。该试验采用醇类溶剂提取法提取披针叶黄华总生物碱，由于原料采用的是全草且采时已过开花时期，故草粉中生物碱含量低，提取总碱量仅占全草质量的0.38%。另一个原因是由于披针叶黄华中以大极性生物碱为主，故采用氯仿未能完全萃取出所含生物碱，应该继续用正丁醇提取残留生物碱。
（2）总碱薄层层析时，乙酸乙脂∶甲醇（3∶1）分离效果最好，在碘化铋钾显色剂下呈现8个点。但在GC-MS分析中，仪器所检测并确定的物质只有7种，含量最小的生物碱仅占总碱的0.3%。因为气质联用仪精密度很高，故推测薄层层析中显色模糊的点有可能是其他生物碱的脱尾。
（3）经质谱数据库检索，确定的7种生物碱，有6种均为已知的披针叶黄华生物碱[9]，而Tetrahydrodeoxoargentamin未见报道存在于该植物当中，需进一步通过红外光谱（IR）、紫外光谱（UV）、核磁共振（NMR）来鉴定其化学结构。以往报道披针叶黄华含量最高的是金雀花碱，约占总碱含量的40%左右[7-8]，而该试验中测得的金雀花碱仅占总碱的0.3%，可能是受植物采摘季节、提取部位以及提取分离方法等因素的影响。
参考文献
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[8] 周云凤，朱忠珂，赵宝玉.披针叶黄华的营养成分及生物碱成分分析[J].动物医学进展，2001（2）：415-418.
[9] 史志诚.动物毒物学[M].北京：中国农业出版社，2001.