目的:建立一种应用荧光免疫组织化学双重标记技术和激光扫描共聚焦显微镜观察不稳定膀胱逼尿肌连接蛋白43表达和分布模式的方法。方法:实验于2003-09/2004-06在汕头大学医学院病理实验室完成。选择健康清洁级wistar大鼠50只,随机分成两组,对照组10只,不稳定膀胱组40只。建立膀胱出口梗阻模型之后行充盈性膀胱测压,确定不稳定膀胱组13只。对照组只行尿道分离术而不作结扎术。麻醉未醒即处死大鼠,取下膀胱分离出逼尿肌组织。①荧光免疫组织化学双重标记:应用罗丹明麦芽凝集素标记逼尿肌肌细胞膜,异硫氰酸荧光素素标记间隙连接蛋白43。②激光共聚焦显微镜技术:使用ACAS/Ultima312型激光共聚焦显微镜的检测器1和检测器2同时分别检测连接蛋白43和细胞膜(当只开通检测通道1时,仅显示代表连接蛋白43的绿色小短杆状或小点状荧光斑;当仅开通检测通道2时,仅显示被染成红色的细胞膜,清楚地显示了细胞的外形轮廓,胞浆及胞核则不显示;当两个通道同时开通时,绿色的连接蛋白43与红色细胞膜重叠后变成黄色)。主要参数如下:小孔孔径225μm,X轴扫描点数390,Y轴扫描点数390,扫描步径0.6μm,镜扫描速度10mm/s,扫描强度85%,激光强度360mW,每点采样次数30,物镜40倍,检测器1(最适波长488nm)灵敏度62%,检测器2(最适波长514nm),灵敏度58%。③激光共聚焦显微镜图像分析法:应用ImageAnalysis程序进行图像分析。以连接蛋白43的像素值占总像素值的百分比值作为连接蛋白43的像素密度,其大小代表连接蛋白43量的大小;以连接蛋白43荧光斑面积的大小反映连接蛋白43量的大小。结果:不稳定膀胱组中出现不稳定膀胱的13只和对照组10只进入结果分析。①两组大鼠逼尿肌连接蛋白43的像素密度和荧光斑面积比较:不稳定膀胱组连接蛋白43象素密度值较对照组象素密度值明显增多(3.45±1.58,0.85±0.44,t=5.037,P<0.01);不稳定膀胱组荧光斑面积较对照组显著增大犤(19.92±8.61)μm2,(11.46±2.55)μm2,t=2.995,P<0.01犦。②激光共聚焦显微镜下双重标记的大鼠逼尿肌连接蛋白43荧光图像:对照组逼尿肌肌束细胞平行排列,分布均匀,连接蛋白43表达量极少。不稳定膀胱组细胞大小不一,形状多样,排列紊乱,连接蛋白43数量较对照组明显增多,表现在密度增大,荧光斑面积增大,连接蛋白43的表达主要出现在细胞与细胞连接处。结论:采用双重标记的荧光免疫组织化学和激光共聚焦显微镜技术,抗连接蛋白43单克隆抗体特异地与间隙连接蛋白43结合,在组织原位上准确地标记间隙连接,同时显示细胞膜,既能对其进行定量分析,又能同时对其进行定位。