论文部分内容阅读
[摘要]目的 探讨肝再生磷酸酶-3（PRL-3）与RhoC在不同病理进程的胃癌组织及癌前病变组织的表达情况及临床意义。方法 采用免疫组化法检测不同病理分期的胃癌组织及癌前病变组织中PRL-3和Rho-C的蛋白表达情况，用统计方法分析二者在不同分组间的表达差异性及二者的相关性。结果 在胃癌中PRL-3阳性表达率为68.0%（34/50），RhoC阳性表达率为62.0%（31/50），二者在胃癌及癌前病变组织之间的表达差异有统计学意义（P<0.001）；二者在不同分化、浸润深度、TNM分期及淋巴结是否转移的分组之间差异有统计学意义（P<0.05），同时二者的表达具有相关性（r.=0.35，P<0.05）。结论 PRL-3与RhoC在胃癌及癌前病变组织的表达水平一定程度上提示二者可能对胃癌的生长及转移有重要的意义：PRL-3可能对RhoC存在调节作用，二者有望成为胃癌早期诊断的标记物，为治疗提供新的靶向分子。
[关键词]胃癌；PRL-3；Rhoc；免疫组化
胃癌是消化系统恶性疾病中最好发的恶性肿瘤之一，据统计在全国范围内其发病率位于恶性肿瘤排名的第二位，并且其患病率中年轻化所占比例较前有所增加。目前传统手术切除、放化疗及新型的分子靶向治疗对晚期胃癌疗效不佳。因此探索胃癌中各致癌因子的作用机制及相互之间的联系，对早期胃癌的诊断和提高晚期胃癌患者的预后具有重要的研究价值。肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3），又称为PTP4A3，是—个双特异性磷酸酶。近年来的研究发现，其参与肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程，被认为是肿瘤诊断和靶向治疗潜在的标志分子。RhoC属于小分子G蛋白超家族中的Rho亚家族.是Rho基因家族的重要成员。RhoC蛋白参与许多重要的细胞活动，如调节细胞骨架蛋白和细胞凋亡.改变细胞黏附和细胞运动。目前的研究发现二者都可促进肿瘤的发生发展.但两者在胃癌中作用的分子机制及两者的相互关系未完全阐明。所以我们采用免疫组化方法检测PRL-3与RhoC在胃癌癌前病变组织、Ⅰ/Ⅱ期胃癌及Ⅲ/Ⅳ期胃癌组织的表达情况，分析其与胃癌病理特征的关系，并探讨两者的表达是否存在相关性。
1.对象与方法
1.1研究对象 收集2015年3月-2016年6月在右江民族医学院附属医院胃肠外科手术切除且资料完整的胃癌患者50例，其中Ⅰ-Ⅱ期22例、Ⅲ-Ⅳ期28例.所有患者术前未经放化疗及免疫治疗，其中男25例，女25例；年龄30-76岁，平均（64.14±12.17）岁；肿瘤分化：高、中分化23例，低分化27例；侵及浆膜及浆膜以外者27例，未侵及浆膜者23例；有淋巴结转移16例，未见淋巴结转移34例。另外收集我院病理科慢性萎缩性胃炎和胃溃疡的石蜡标本，按病检结果分类：肠腺化生、低级别瘤变、高级别瘤变，样本量各50例。
1.2检测方法 新鲜标本常规用10%中性甲醛溶液固定，24 h内取材，脱水、透明、石蜡包埋，连续4Ixm厚度切片。免疫组化法：常规二甲苯、乙醇逐级脱蜡至水化.除去内源性的过氧化氢酶，加柠檬酸盐缓冲液后微波修复抗原，自然冷却至室温，加血清封闭，加一抗（选择合适的稀释比例：1：80的抗PRL-3抗体，1：60的抗RhoC抗体），将切片放入湿盒中，再将湿盒于40C冰箱过夜，第二日将湿盒放人37℃温箱中复温0.5 h，PBS洗5 min×3次，加二抗，加DAB显色剂，水洗终止显色，苏木精复染，逐级酒精脱水，中性树胶封片，电热扇吹干后镜下观察。用PRL-3强阳性表达的结肠癌、RhoC强阳性表达的十二指肠癌组织切片作为阳性对照.PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3结果判断标准 每张切片由我院病理科两位高级职称医师独立阅片，随机选10个不同的视野分别计数阳性细胞数并计算其算术平均值。采用双评分半定量法进行评分。（1）显色度按切片中细胞显色有无及深浅记分：细胞不显色记为0分，浅棕黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。（2）对于每张切片中阳性肿瘤细胞或变性细胞所占百分比分四个等级：阳性细胞<10%記为0分，10%-25%记为1分，26%-50%记为2分，>50%记为3分。（3）将（1）、（2）得分相加，得0-1分为（-）阴性表达，2-3分为（+）低度表达，4-5分为（++）中度表达，6分为（+++）强度表达。即2-6为阳性。
1.4统计学方法 数据均采用SPSS 19.0软件进行处理，计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用x2检验，等级分组资料采用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法）.进一步两两比较采用4个样本间两两比较的秩和检验（Nemenyi法），对两者表达的相关性基于有序变量的等级资料采用Spearman检验进行统计学分析，检验水准：a=0.05。
2.结果
2.1免疫组织化学染色 显示PRL-3和RhoC蛋白表达主要定位于细胞质或细胞膜上，呈黄色、棕黄色及棕褐色颗粒。见图1。
2.2PRL-3与RhoC在胃癌及癌前病变组织的表达情况 PRL-3、RhoC在胃癌组织及癌前病变组织中的表达差异均有统计学意义（P<0.001），再依次两两比较，部分类型之间差异有统计学意义（P<0.05），提示，PRL-3和RhoC蛋白阳性表达率随着胃黏膜从肠上皮化生逐渐向癌变演变，其强弱顺序均为：肠上皮化生<低级别瘤变<高级瘤变<胃癌。见表1、表2。
2.3PRL-3和RhoC的表达与胃癌临床病理学特征的关系 50例胃癌组织中有34例PRL-3蛋白呈阳性表达，阳性表达率为68.0%，其表达与胃癌患者的性别、年龄大小无明显相关（P>0.05），但是随着胃癌组织浸润深度的加深、分化程度的降低及淋巴结转移的发生.其阳性表达率明显升高，表达差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。50例胃癌组织中有31例RhoC呈阳性表达，阳性表达率为62.0%，其表达与胃癌患者的性别、年龄大小无明显相关（P>0.05），但是随着胃癌组织浸润深度的加深、分化程度的降低及淋巴结转移的发生，其阳性表达率明显升高，表达差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表3。 2.4PRL-3与RhoC在胃癌组织中表达情况的相关性分析 基于有序变量的等级资料.应用Spearman检验对PRL-3和RhoC蛋白在胃癌中表达相关性进行分析，结果：r.=0.35，P<0.05，说明二者在胃癌中的表达存在较强的相关性。见表4。
3.讨论
PRL-3是相对分子质量为22 kD的非典型磷酸酪氨酸蛋白磷酸酯酶，其分子结构特点是有氨基末端的PTP催化活性结构域和羧基末端的异戊二烯化修饰位点CAAX序列。国外学者Saha等首次发现PRL-3在结肠癌中高表达并与转移密切相关，后续的研究者发现它在多种肿瘤组织中高表达，诸如：乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等。蔡世荣等对137例胃癌组织进行免疫组化检测，发现PRL-3高表达的胃癌患者占62%和低-中度的PRL-3表达的胃癌患者占19%，并且PRL-3的表达在有淋巴结转移的胃癌组织明显高于无淋巴结转移的胃癌组织。尽管PRL-3与肿瘤关系的分子机制未完全阐明.但越来越多的研究证明其对恶性肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移作用，与其介导的上皮细胞间质转化（EMT）、上调金属蛋白酶（MMP）降解基质和诱导肿瘤新生血管生成的机制密不可分。PRL-3的这些生物学功能一定程度上解释了它在恶性肿瘤中所起的重要作用。我们通过免疫组化法研究了PRL-3在胃癌癌前病变组织（肠上皮化生、低级别瘤变、高级瘤变）的表达时，发现随着胃黏膜癌前病变组织逐渐向胃癌演变.其表达强度依次呈递增趋势.由此我们推测PRL-3可能在胃癌的发生发展中起着重要作用。在50例胃癌组织中，PRL-3阳性表达率为68%，其与胃癌的浸润深度、分化程度、TNM分期及淋巴结转移呈正相关。这些研究结果与前人的研究有所相似，进一步揭示了PRL-3与胃癌转移的密切关系。
RhoC蛋白是RhoGTP酶家族的一个重要的成员，其基因定位于lpl3-p21，其蛋白含193个氨基酸，相对分子质量大约为21 KD的GTP结合蛋白。Clark等首次应用DNA Array检测发现RhoC基因的表达与黑色素瘤的高转移性直接相关，从此研究者们开启了RhoC对肿瘤转移关系的研究。相继的研究发现.RhoC亦在多种肿瘤组织中高表达，其可通过相关信号通道促进肿瘤组织EMT的发生和肿瘤血管的形成，进而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。近年来研究者们陆续发现RhoC还能明显上调MMPs的表达水平及增加其活性，使降解胞外基质能力增强，从而导致肿瘤侵袭活性的增强。本研究免疫组化结果显示，RhoC在胃癌及癌前病变组织的表达情况，如同前文PRL-3所述的表达，这一现象提示两者可能存在相互作用，共同参与胃癌转移的调节过程。
我们的研究还发现.PRL-3与RhoC在胃癌中的表达呈正相关，在浸润较深、组织分化低、有淋巴结转移的胃癌组织中RL-3和RhoC蛋白的表达都较高，与张平等人的研究结果一致。覃宗帅等用不同浓度的PRL-3抗体作用于胃癌SGC7901细胞后.发现较高浓度的PRL-3抗体能明显下调RhoCmRNA和蛋白的表达量。Ming等阻断PRL-3在肺癌A549细胞的表达后，RhoC的表达亦受到抑制，接着再阻断RhoC的表达，PRL-3的表达不受影响。通过本实验的研究结合上述研究者的研究结果，可以推测PRL-3与RhoC可能在同一信号通道中，PRL-3可能通过调控RhoC的表达促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭，尤其对胃癌的转移起着重要的作用。但PRL-3是否直接作用于RhoC，是否涉及其他分子調节RhoC蛋白，同时RhoC蛋白是否对PRL-3具有反馈作用等还需进一步的实验来阐明。
[关键词]胃癌；PRL-3；Rhoc；免疫组化
胃癌是消化系统恶性疾病中最好发的恶性肿瘤之一，据统计在全国范围内其发病率位于恶性肿瘤排名的第二位，并且其患病率中年轻化所占比例较前有所增加。目前传统手术切除、放化疗及新型的分子靶向治疗对晚期胃癌疗效不佳。因此探索胃癌中各致癌因子的作用机制及相互之间的联系，对早期胃癌的诊断和提高晚期胃癌患者的预后具有重要的研究价值。肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3），又称为PTP4A3，是—个双特异性磷酸酶。近年来的研究发现，其参与肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程，被认为是肿瘤诊断和靶向治疗潜在的标志分子。RhoC属于小分子G蛋白超家族中的Rho亚家族.是Rho基因家族的重要成员。RhoC蛋白参与许多重要的细胞活动，如调节细胞骨架蛋白和细胞凋亡.改变细胞黏附和细胞运动。目前的研究发现二者都可促进肿瘤的发生发展.但两者在胃癌中作用的分子机制及两者的相互关系未完全阐明。所以我们采用免疫组化方法检测PRL-3与RhoC在胃癌癌前病变组织、Ⅰ/Ⅱ期胃癌及Ⅲ/Ⅳ期胃癌组织的表达情况，分析其与胃癌病理特征的关系，并探讨两者的表达是否存在相关性。
1.对象与方法
1.1研究对象 收集2015年3月-2016年6月在右江民族医学院附属医院胃肠外科手术切除且资料完整的胃癌患者50例，其中Ⅰ-Ⅱ期22例、Ⅲ-Ⅳ期28例.所有患者术前未经放化疗及免疫治疗，其中男25例，女25例；年龄30-76岁，平均（64.14±12.17）岁；肿瘤分化：高、中分化23例，低分化27例；侵及浆膜及浆膜以外者27例，未侵及浆膜者23例；有淋巴结转移16例，未见淋巴结转移34例。另外收集我院病理科慢性萎缩性胃炎和胃溃疡的石蜡标本，按病检结果分类：肠腺化生、低级别瘤变、高级别瘤变，样本量各50例。
1.2检测方法 新鲜标本常规用10%中性甲醛溶液固定，24 h内取材，脱水、透明、石蜡包埋，连续4Ixm厚度切片。免疫组化法：常规二甲苯、乙醇逐级脱蜡至水化.除去内源性的过氧化氢酶，加柠檬酸盐缓冲液后微波修复抗原，自然冷却至室温，加血清封闭，加一抗（选择合适的稀释比例：1：80的抗PRL-3抗体，1：60的抗RhoC抗体），将切片放入湿盒中，再将湿盒于40C冰箱过夜，第二日将湿盒放人37℃温箱中复温0.5 h，PBS洗5 min×3次，加二抗，加DAB显色剂，水洗终止显色，苏木精复染，逐级酒精脱水，中性树胶封片，电热扇吹干后镜下观察。用PRL-3强阳性表达的结肠癌、RhoC强阳性表达的十二指肠癌组织切片作为阳性对照.PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3结果判断标准 每张切片由我院病理科两位高级职称医师独立阅片，随机选10个不同的视野分别计数阳性细胞数并计算其算术平均值。采用双评分半定量法进行评分。（1）显色度按切片中细胞显色有无及深浅记分：细胞不显色记为0分，浅棕黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。（2）对于每张切片中阳性肿瘤细胞或变性细胞所占百分比分四个等级：阳性细胞<10%記为0分，10%-25%记为1分，26%-50%记为2分，>50%记为3分。（3）将（1）、（2）得分相加，得0-1分为（-）阴性表达，2-3分为（+）低度表达，4-5分为（++）中度表达，6分为（+++）强度表达。即2-6为阳性。
1.4统计学方法 数据均采用SPSS 19.0软件进行处理，计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用x2检验，等级分组资料采用成组设计多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis法）.进一步两两比较采用4个样本间两两比较的秩和检验（Nemenyi法），对两者表达的相关性基于有序变量的等级资料采用Spearman检验进行统计学分析，检验水准：a=0.05。
2.结果
2.1免疫组织化学染色 显示PRL-3和RhoC蛋白表达主要定位于细胞质或细胞膜上，呈黄色、棕黄色及棕褐色颗粒。见图1。
2.2PRL-3与RhoC在胃癌及癌前病变组织的表达情况 PRL-3、RhoC在胃癌组织及癌前病变组织中的表达差异均有统计学意义（P<0.001），再依次两两比较，部分类型之间差异有统计学意义（P<0.05），提示，PRL-3和RhoC蛋白阳性表达率随着胃黏膜从肠上皮化生逐渐向癌变演变，其强弱顺序均为：肠上皮化生<低级别瘤变<高级瘤变<胃癌。见表1、表2。
2.3PRL-3和RhoC的表达与胃癌临床病理学特征的关系 50例胃癌组织中有34例PRL-3蛋白呈阳性表达，阳性表达率为68.0%，其表达与胃癌患者的性别、年龄大小无明显相关（P>0.05），但是随着胃癌组织浸润深度的加深、分化程度的降低及淋巴结转移的发生.其阳性表达率明显升高，表达差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。50例胃癌组织中有31例RhoC呈阳性表达，阳性表达率为62.0%，其表达与胃癌患者的性别、年龄大小无明显相关（P>0.05），但是随着胃癌组织浸润深度的加深、分化程度的降低及淋巴结转移的发生，其阳性表达率明显升高，表达差异有统计学意义（P<0.05或0.01）。见表3。 2.4PRL-3与RhoC在胃癌组织中表达情况的相关性分析 基于有序变量的等级资料.应用Spearman检验对PRL-3和RhoC蛋白在胃癌中表达相关性进行分析，结果：r.=0.35，P<0.05，说明二者在胃癌中的表达存在较强的相关性。见表4。
3.讨论
PRL-3是相对分子质量为22 kD的非典型磷酸酪氨酸蛋白磷酸酯酶，其分子结构特点是有氨基末端的PTP催化活性结构域和羧基末端的异戊二烯化修饰位点CAAX序列。国外学者Saha等首次发现PRL-3在结肠癌中高表达并与转移密切相关，后续的研究者发现它在多种肿瘤组织中高表达，诸如：乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等。蔡世荣等对137例胃癌组织进行免疫组化检测，发现PRL-3高表达的胃癌患者占62%和低-中度的PRL-3表达的胃癌患者占19%，并且PRL-3的表达在有淋巴结转移的胃癌组织明显高于无淋巴结转移的胃癌组织。尽管PRL-3与肿瘤关系的分子机制未完全阐明.但越来越多的研究证明其对恶性肿瘤的增殖、迁移、侵袭和转移作用，与其介导的上皮细胞间质转化（EMT）、上调金属蛋白酶（MMP）降解基质和诱导肿瘤新生血管生成的机制密不可分。PRL-3的这些生物学功能一定程度上解释了它在恶性肿瘤中所起的重要作用。我们通过免疫组化法研究了PRL-3在胃癌癌前病变组织（肠上皮化生、低级别瘤变、高级瘤变）的表达时，发现随着胃黏膜癌前病变组织逐渐向胃癌演变.其表达强度依次呈递增趋势.由此我们推测PRL-3可能在胃癌的发生发展中起着重要作用。在50例胃癌组织中，PRL-3阳性表达率为68%，其与胃癌的浸润深度、分化程度、TNM分期及淋巴结转移呈正相关。这些研究结果与前人的研究有所相似，进一步揭示了PRL-3与胃癌转移的密切关系。
RhoC蛋白是RhoGTP酶家族的一个重要的成员，其基因定位于lpl3-p21，其蛋白含193个氨基酸，相对分子质量大约为21 KD的GTP结合蛋白。Clark等首次应用DNA Array检测发现RhoC基因的表达与黑色素瘤的高转移性直接相关，从此研究者们开启了RhoC对肿瘤转移关系的研究。相继的研究发现.RhoC亦在多种肿瘤组织中高表达，其可通过相关信号通道促进肿瘤组织EMT的发生和肿瘤血管的形成，进而促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。近年来研究者们陆续发现RhoC还能明显上调MMPs的表达水平及增加其活性，使降解胞外基质能力增强，从而导致肿瘤侵袭活性的增强。本研究免疫组化结果显示，RhoC在胃癌及癌前病变组织的表达情况，如同前文PRL-3所述的表达，这一现象提示两者可能存在相互作用，共同参与胃癌转移的调节过程。
我们的研究还发现.PRL-3与RhoC在胃癌中的表达呈正相关，在浸润较深、组织分化低、有淋巴结转移的胃癌组织中RL-3和RhoC蛋白的表达都较高，与张平等人的研究结果一致。覃宗帅等用不同浓度的PRL-3抗体作用于胃癌SGC7901细胞后.发现较高浓度的PRL-3抗体能明显下调RhoCmRNA和蛋白的表达量。Ming等阻断PRL-3在肺癌A549细胞的表达后，RhoC的表达亦受到抑制，接着再阻断RhoC的表达，PRL-3的表达不受影响。通过本实验的研究结合上述研究者的研究结果，可以推测PRL-3与RhoC可能在同一信号通道中，PRL-3可能通过调控RhoC的表达促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭，尤其对胃癌的转移起着重要的作用。但PRL-3是否直接作用于RhoC，是否涉及其他分子調节RhoC蛋白，同时RhoC蛋白是否对PRL-3具有反馈作用等还需进一步的实验来阐明。