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摘要 [目的]研究浒苔代谢产物的提取方法。[方法]以浒苔为研究对象，用不同的细胞破碎方式、溶剂提取体系、料液比等对均一样本的代谢产物进行提取，气相色谱-质谱法（GC-MS）鉴定代谢产物成分，利用主成分分析等方法，对不同的代谢提取体系进行评价。[结果]溶剂体系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮处理-球磨破碎-超声波的破壁方法提取并鉴定出81种代谢产物，该方法具有高提取产率、高重现性、易操作和速度快等优点。[结论]溶剂体系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮处理-球磨破碎-超声波破壁是适合浒苔代谢物提取的方法，该方法可为浒苔及大型绿藻的代谢组学研究提供参考。
关键词 浒苔；提取方法；气相色谱-质谱；代谢产物
中图分类号 S986.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0072-04
Metabolite Profiling of Seaweed Enteromorpha Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry
HE Yan-li1，2， WANG Yan-hui1， CHEN Fang-yuan1， XU Nian-jun2* et al
（1. School of Pharmaceutical Engineering， Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100； 2. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo， Zhejiang 315211）
Abstract [Objective] To study the extraction method of Enteromorpha metabolites. [Method] Enteromorpha as the research object， using different cell crushing methods， solvent extraction system， solid-liquid ratio， the homogeneous sample metabolites were extracted； the metabolites were identificated by GC-MS； using principal component analysis method， different metabolic extraction systems were evaluated. [Result] A total of 81 metabolites were extracted and identified by the solvent system of methanol∶chloroform∶water （7∶3∶3） and liquid nitrogen treatment-milling-ultrasonic breaking method， showing high extraction yield， high reproducibility， easy operation and fast and other characteristics. [Conclusion] It is a suitable method for extracting metabolites of Enteromorpha which can provide reference for metabonomics study of Enteromorpha and large green algae.
Key words Enteromorpha；Extraction method；GC-MS；Metabolite
滸苔（Enteromorpha）亦称苔条、苔菜，属绿藻纲石莼科，为大型海洋绿藻，广温、广盐、耐干旱，在我国近海广泛分布。在适合条件下容易出现爆发型增殖，给水产养殖造成严重困扰，其生态危害受到广泛关注。同时浒苔又有较高的营养价值，浒苔“烧末吹鼻止衄血，汤浸捣敷手背肿痛”，具有软坚散结、化痰消积、解毒消肿等作用；浒苔富含蛋白质、纤维素、碳水化合物和维生素等营养成分，在日韩等国家作为中高档的佐料消费[1]，且价格昂贵。
浒苔在近海中的绿潮爆发极具规律：每年4、5月份在山东、江苏、浙江等局部海域爆发，爆发期间对当地水产养殖造成极大损失[2]，对近海环境也产生不良影响，而其他时间附近海域则较少出现。关于其爆发机制以及如何减少其危害、提高对其有效利用仍需深入研究。近年来对浒苔的研究逐渐增多，但主要集中在其生理和繁殖状态观察方面[3-4]，浒苔绿潮爆发情况下，浒苔代谢组的研究还未见报道。
代谢组学为分析植物细胞活动、次生代谢网络提供了依据[5-7]。近年来随着相关数据处理软件和植物代谢组数据库的完善，代谢组学的应用成为植物代谢通路研究不可或缺的一部分，其提取方法直接影响试验结果[8-9]，而不同物种的植物代谢产物具有一定的物种特异性，因此，建立并优化基于气相色谱-质谱法（GC-MS）的浒苔代谢产物提取方法很有必要。
笔者通过比较不同的细胞破碎方法和提取溶剂等提取因素，对适合浒苔水相代谢产物的提取方法进行优化；通过该方法，测定并解析基于GC-MS的浒苔中基本的代谢图谱，为后续的浒苔代谢组研究和类似的大型海洋绿藻的代谢组研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 主要试剂：三氯甲烷、正己烷、石油醚、甲醇、均为色谱级试剂，购自 Thermo Fisher公司；衍生化试剂N-甲基-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），购自Aldrich。 主要仪器：GC-MS气质联用仪（Trace1300-ITQ900，赛默飞，美国）；色谱柱为TR-5ms 弱极性色谱柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；JXFSTPRP-24球磨仪，上海净信科技；CV200冷冻旋转蒸干仪，北京艾吉姆。
1.2 方法
1.2.1 藻种及培养方法。
浒苔分离自象山港塔头旺近海海域，加冰并在5 h内运输至实验室。正式试验前进行纯化培养，采用人工海水，盐度30， f/2培养基（不加硅）加富，温度为（25.0±0.5）℃，光照强度为 4 000 lx，光暗周期12 h∶12 h，隔天换水。
1.2.2 代谢物提取方法。2种细胞破碎方法：a.液氮研磨-超声波；b.液氮处理-球磨破碎-超声波。此处的液氮处理为样品取出后，加入液氮用于酶等生物活性物质的灭活，不研磨。3种溶剂体系：①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；②甲醇-水（7∶3）；③甲醇-正己烷-三氯甲烷-水（1∶1∶1∶1）。采用上述2种破碎方法和3种溶剂体系提取浒苔代谢产物。
具体操作如下：准确称取 20 mg浒苔冻干样品（n=3），采用液氮研磨后，加入1 mL提取溶剂，冰浴超声波1 min停顿1 min，重复10次。与3种溶剂组合后优选出最佳溶剂组合后，分别结合3种细胞破碎方法，选择最佳细胞破碎方式，最后进行料液比试验。
1.2.3 GC-MS测试条件。柱前衍生，衍生条件：挥干有机相→加入50 μL甲氧氨基化试剂（甲氧氨基盐酸盐，20 mg/mL吡啶溶液）→30 ℃振荡孵化90 min→加入90 μL MSTFA衍生化试剂→37 ℃恒温孵化30 min→室温放置2 h。
进样口温度250 ℃，不分流进样，流速1.0 mL/min。程序升温：50 ℃保留3 min，10 ℃/min 到250 ℃，保留5 min。传输线温度250 ℃，EI源温度230 ℃，质荷比35～500。
2 结果与分析
2.1 溶剂提取优化
以提取代谢物种类、有效峰面积为指标，对不同的溶剂提取体系进行效果评价。液氮研磨后分别采用3种溶剂体系提取。结果如图1和图2所示，组合a②提取的物质较少，只有61种，a①和a③较多，溶剂体系①和③提取物质种类没有显著差异，但③中杂峰较多，有效峰面积仅为72%，因此，选择①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）作为提取溶剂。
2.2 细胞破碎方式的选择及料液比优化
以提取的代谢产物种类、有效峰面积和重现性為依据，对细胞破碎方式进行优化。由图3可以看出，液氮研磨-超声波破碎细胞的提取物质种类较多，平均为82种，但其与液氮处理-球磨仪-超声波处理方法提取的物质总数没有显著差异。
重现性：图4中， b1～b8为同一组样品的重复，a1～a9为同一样品的重复。在主成分分析图中，每个样品数据对应一个点， 样品数据越相似，其在主成分分析图上对应的点之间的距离就越近，其集中程度反映了处理样品重现性的高低。理想状态下，b1～b8 和a1～a9分别集中在一起，从图4可以看出，三角形和正方形分布于中间轴的两侧，说明2组差异显著。b1～b8高度集中，而a1～a9分散于右边半个区域，即方法a①组内差异明显比方法b①大。这可能是液氮研磨是人工手动，当样品数量多时，对人力消耗较大，造成研磨重现性差。另外，由于液氮研磨是将样品直接置于研钵中，研磨过程会损耗一部分样品，样品量少的情况不适合用该种方法。球磨仪破碎和超声波破碎细胞时，可以将样品称重后放EP管中，破碎后直接加入萃取溶剂，避免了二次转移，减少了对样品的损耗，对样品量的要求降低。另外，利用球磨仪破碎时采用了批量处理，这应该是其组内差异小的原因之一。基于此，将样品前期用液氮灭活，然后采用球磨仪和超声波进行细胞破碎的方法是较好的代谢组细胞破壁方法。
2.3 浒苔代谢产物分析
经Nist数据库比对，结合已有文献[5]和Massbank数据库参考，分析并鉴定提取浒苔代谢产物81种。其中，氨基酸18种，含量占11.511%，涵盖常见的必需氨基酸和非必需氨基酸；酸类24种，含量11.600%，主要是参与三羧酸循环的小分子羧酸，为重要的代谢组分；糖类10种，含量67.78%；另有芳香酸、醇类、萜、烯醇等。
3 结论与讨论
通过比较不同的细胞破碎方法和提取溶剂等提取因素，发现选择提取溶剂采用甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；细胞破壁方法采用将样品前期用液氮灭活，然后采用球磨仪和超声波进行细胞破碎得到的代谢产物较多（81种），平行性和重复性都较另外几种方法稳定，GC-MS分离鉴定出24种酸、10种糖、18种氨基酸等物质。
溶剂提取方法的结果与张晓飞等[10]的研究结果相近，这说明植物中一部分代谢产物相对保守，但是3种溶剂的比例不同，可能因为这2种植物中的极性和非极性的代谢产物比例不同。该提取方法与分类提取的差异不大，有些甚至还由于单独分类提取：如齐晓辉等[11]等提取浒苔多糖，最后得到12种，该试验得到了10种；提取和分离鉴定的氨基酸中谷氨酸含量较高，这与徐大伦[12]的研究相近，并且该方法提取的氨基酸为18种，比徐大伦的提取方法多了1种；该方法分离鉴定出的24种酸中，其中亚麻酸含量较高，这与孙伟红等[13]的研究结果相同。综上，该方法对不同种类小分子代谢物得到了比较充分的提取，为进一步研究浒苔代谢奠定基础。
参考文献
[1] 尹琳琳，杨佰娟，郑立，等.浒苔脂肪酸前处理方法优化及GC/MS分析[J].海洋科学，2010，34（11）：46-50.
[2] 孙元芹，李翘楚，李红艳，等.浒苔生理活性与开发利用研究进展[J].水产科学，2013，32（4）：244-248. [3] 李俭平.浒苔对氮营养盐的响应及其氮营养盐吸收动力学和生理生态研究[D].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2011.
[4] 刘峰.黄海绿潮的成因以及绿潮浒苔的生理生态学和分子系统学研究[D].青岛：中国科學院研究生院（海洋研究所），2010.
[5] SUN Y Y，WANG H，GUO G L，et al.Isolation，purification，and identification of antialgal substances in green alga Ulva prolifera for antialgal activity against the common harmful red tide microalgae[J].Environmental science and pollution research，2016，23（2）：1449-1459.
[6] WANG Y，YU Z M，SONG X X，et al.Effects of macroalgae Ulva pertusa（Chlorophyta） and Gracilaria lemaneiformis（Rhodophyta） on growth of four species of bloom-for ming dinoflagellates[J].Aquatic botany，2007，86（2）：139-147.
[7] 滕中秋，付卉青，贾少华，等.植物应答非生物胁迫的代谢组学研究进展[J].植物生态学报，2011，35（1）：110-118.
[8] TRETYN A，LUKASIEWICZ-RUTKOWSKA H，KOPCEWICZ J.Isolation，purification and identification of acetylcholine in Pharbitis nil seedlings[J].Acta Physiol Plant，1997，19（3）：303-309.
[9] WANT E J，O’MAILLE Q，SMITH C A，et al.Solvent-dependent metabolite distribution，clustering，and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry[J].Anal Chem，2005，78（3）：743-752.
[10] 张晓飞，段礼新，龚月桦，等.用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法[J].生物工程学报，2014，30（2）：294-304.
[11] 齐晓辉，李红燕，郭守东，等.4种不同来源浒苔中多糖的提取分离及理化性质[J].青岛：中国海洋大学学报（自然科学版），2010，40（5）：15-18.
[12] 徐大伦.浒苔主要化学组分的分析及多糖活性的研究[D].青岛：中国海洋大学 ，2004.
[13] 孙伟红，冷凯良，王志杰，等.浒苔的氨基酸和脂肪酸组成研究[J].渔业科学进展，2009，30（2）：106-114.
关键词 浒苔；提取方法；气相色谱-质谱；代谢产物
中图分类号 S986.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0072-04
Metabolite Profiling of Seaweed Enteromorpha Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry
HE Yan-li1，2， WANG Yan-hui1， CHEN Fang-yuan1， XU Nian-jun2* et al
（1. School of Pharmaceutical Engineering， Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100； 2. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo， Zhejiang 315211）
Abstract [Objective] To study the extraction method of Enteromorpha metabolites. [Method] Enteromorpha as the research object， using different cell crushing methods， solvent extraction system， solid-liquid ratio， the homogeneous sample metabolites were extracted； the metabolites were identificated by GC-MS； using principal component analysis method， different metabolic extraction systems were evaluated. [Result] A total of 81 metabolites were extracted and identified by the solvent system of methanol∶chloroform∶water （7∶3∶3） and liquid nitrogen treatment-milling-ultrasonic breaking method， showing high extraction yield， high reproducibility， easy operation and fast and other characteristics. [Conclusion] It is a suitable method for extracting metabolites of Enteromorpha which can provide reference for metabonomics study of Enteromorpha and large green algae.
Key words Enteromorpha；Extraction method；GC-MS；Metabolite
滸苔（Enteromorpha）亦称苔条、苔菜，属绿藻纲石莼科，为大型海洋绿藻，广温、广盐、耐干旱，在我国近海广泛分布。在适合条件下容易出现爆发型增殖，给水产养殖造成严重困扰，其生态危害受到广泛关注。同时浒苔又有较高的营养价值，浒苔“烧末吹鼻止衄血，汤浸捣敷手背肿痛”，具有软坚散结、化痰消积、解毒消肿等作用；浒苔富含蛋白质、纤维素、碳水化合物和维生素等营养成分，在日韩等国家作为中高档的佐料消费[1]，且价格昂贵。
浒苔在近海中的绿潮爆发极具规律：每年4、5月份在山东、江苏、浙江等局部海域爆发，爆发期间对当地水产养殖造成极大损失[2]，对近海环境也产生不良影响，而其他时间附近海域则较少出现。关于其爆发机制以及如何减少其危害、提高对其有效利用仍需深入研究。近年来对浒苔的研究逐渐增多，但主要集中在其生理和繁殖状态观察方面[3-4]，浒苔绿潮爆发情况下，浒苔代谢组的研究还未见报道。
代谢组学为分析植物细胞活动、次生代谢网络提供了依据[5-7]。近年来随着相关数据处理软件和植物代谢组数据库的完善，代谢组学的应用成为植物代谢通路研究不可或缺的一部分，其提取方法直接影响试验结果[8-9]，而不同物种的植物代谢产物具有一定的物种特异性，因此，建立并优化基于气相色谱-质谱法（GC-MS）的浒苔代谢产物提取方法很有必要。
笔者通过比较不同的细胞破碎方法和提取溶剂等提取因素，对适合浒苔水相代谢产物的提取方法进行优化；通过该方法，测定并解析基于GC-MS的浒苔中基本的代谢图谱，为后续的浒苔代谢组研究和类似的大型海洋绿藻的代谢组研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料 主要试剂：三氯甲烷、正己烷、石油醚、甲醇、均为色谱级试剂，购自 Thermo Fisher公司；衍生化试剂N-甲基-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），购自Aldrich。 主要仪器：GC-MS气质联用仪（Trace1300-ITQ900，赛默飞，美国）；色谱柱为TR-5ms 弱极性色谱柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；JXFSTPRP-24球磨仪，上海净信科技；CV200冷冻旋转蒸干仪，北京艾吉姆。
1.2 方法
1.2.1 藻种及培养方法。
浒苔分离自象山港塔头旺近海海域，加冰并在5 h内运输至实验室。正式试验前进行纯化培养，采用人工海水，盐度30， f/2培养基（不加硅）加富，温度为（25.0±0.5）℃，光照强度为 4 000 lx，光暗周期12 h∶12 h，隔天换水。
1.2.2 代谢物提取方法。2种细胞破碎方法：a.液氮研磨-超声波；b.液氮处理-球磨破碎-超声波。此处的液氮处理为样品取出后，加入液氮用于酶等生物活性物质的灭活，不研磨。3种溶剂体系：①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；②甲醇-水（7∶3）；③甲醇-正己烷-三氯甲烷-水（1∶1∶1∶1）。采用上述2种破碎方法和3种溶剂体系提取浒苔代谢产物。
具体操作如下：准确称取 20 mg浒苔冻干样品（n=3），采用液氮研磨后，加入1 mL提取溶剂，冰浴超声波1 min停顿1 min，重复10次。与3种溶剂组合后优选出最佳溶剂组合后，分别结合3种细胞破碎方法，选择最佳细胞破碎方式，最后进行料液比试验。
1.2.3 GC-MS测试条件。柱前衍生，衍生条件：挥干有机相→加入50 μL甲氧氨基化试剂（甲氧氨基盐酸盐，20 mg/mL吡啶溶液）→30 ℃振荡孵化90 min→加入90 μL MSTFA衍生化试剂→37 ℃恒温孵化30 min→室温放置2 h。
进样口温度250 ℃，不分流进样，流速1.0 mL/min。程序升温：50 ℃保留3 min，10 ℃/min 到250 ℃，保留5 min。传输线温度250 ℃，EI源温度230 ℃，质荷比35～500。
2 结果与分析
2.1 溶剂提取优化
以提取代谢物种类、有效峰面积为指标，对不同的溶剂提取体系进行效果评价。液氮研磨后分别采用3种溶剂体系提取。结果如图1和图2所示，组合a②提取的物质较少，只有61种，a①和a③较多，溶剂体系①和③提取物质种类没有显著差异，但③中杂峰较多，有效峰面积仅为72%，因此，选择①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）作为提取溶剂。
2.2 细胞破碎方式的选择及料液比优化
以提取的代谢产物种类、有效峰面积和重现性為依据，对细胞破碎方式进行优化。由图3可以看出，液氮研磨-超声波破碎细胞的提取物质种类较多，平均为82种，但其与液氮处理-球磨仪-超声波处理方法提取的物质总数没有显著差异。
重现性：图4中， b1～b8为同一组样品的重复，a1～a9为同一样品的重复。在主成分分析图中，每个样品数据对应一个点， 样品数据越相似，其在主成分分析图上对应的点之间的距离就越近，其集中程度反映了处理样品重现性的高低。理想状态下，b1～b8 和a1～a9分别集中在一起，从图4可以看出，三角形和正方形分布于中间轴的两侧，说明2组差异显著。b1～b8高度集中，而a1～a9分散于右边半个区域，即方法a①组内差异明显比方法b①大。这可能是液氮研磨是人工手动，当样品数量多时，对人力消耗较大，造成研磨重现性差。另外，由于液氮研磨是将样品直接置于研钵中，研磨过程会损耗一部分样品，样品量少的情况不适合用该种方法。球磨仪破碎和超声波破碎细胞时，可以将样品称重后放EP管中，破碎后直接加入萃取溶剂，避免了二次转移，减少了对样品的损耗，对样品量的要求降低。另外，利用球磨仪破碎时采用了批量处理，这应该是其组内差异小的原因之一。基于此，将样品前期用液氮灭活，然后采用球磨仪和超声波进行细胞破碎的方法是较好的代谢组细胞破壁方法。
2.3 浒苔代谢产物分析
经Nist数据库比对，结合已有文献[5]和Massbank数据库参考，分析并鉴定提取浒苔代谢产物81种。其中，氨基酸18种，含量占11.511%，涵盖常见的必需氨基酸和非必需氨基酸；酸类24种，含量11.600%，主要是参与三羧酸循环的小分子羧酸，为重要的代谢组分；糖类10种，含量67.78%；另有芳香酸、醇类、萜、烯醇等。
3 结论与讨论
通过比较不同的细胞破碎方法和提取溶剂等提取因素，发现选择提取溶剂采用甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；细胞破壁方法采用将样品前期用液氮灭活，然后采用球磨仪和超声波进行细胞破碎得到的代谢产物较多（81种），平行性和重复性都较另外几种方法稳定，GC-MS分离鉴定出24种酸、10种糖、18种氨基酸等物质。
溶剂提取方法的结果与张晓飞等[10]的研究结果相近，这说明植物中一部分代谢产物相对保守，但是3种溶剂的比例不同，可能因为这2种植物中的极性和非极性的代谢产物比例不同。该提取方法与分类提取的差异不大，有些甚至还由于单独分类提取：如齐晓辉等[11]等提取浒苔多糖，最后得到12种，该试验得到了10种；提取和分离鉴定的氨基酸中谷氨酸含量较高，这与徐大伦[12]的研究相近，并且该方法提取的氨基酸为18种，比徐大伦的提取方法多了1种；该方法分离鉴定出的24种酸中，其中亚麻酸含量较高，这与孙伟红等[13]的研究结果相同。综上，该方法对不同种类小分子代谢物得到了比较充分的提取，为进一步研究浒苔代谢奠定基础。
参考文献
[1] 尹琳琳，杨佰娟，郑立，等.浒苔脂肪酸前处理方法优化及GC/MS分析[J].海洋科学，2010，34（11）：46-50.
[2] 孙元芹，李翘楚，李红艳，等.浒苔生理活性与开发利用研究进展[J].水产科学，2013，32（4）：244-248. [3] 李俭平.浒苔对氮营养盐的响应及其氮营养盐吸收动力学和生理生态研究[D].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2011.
[4] 刘峰.黄海绿潮的成因以及绿潮浒苔的生理生态学和分子系统学研究[D].青岛：中国科學院研究生院（海洋研究所），2010.
[5] SUN Y Y，WANG H，GUO G L，et al.Isolation，purification，and identification of antialgal substances in green alga Ulva prolifera for antialgal activity against the common harmful red tide microalgae[J].Environmental science and pollution research，2016，23（2）：1449-1459.
[6] WANG Y，YU Z M，SONG X X，et al.Effects of macroalgae Ulva pertusa（Chlorophyta） and Gracilaria lemaneiformis（Rhodophyta） on growth of four species of bloom-for ming dinoflagellates[J].Aquatic botany，2007，86（2）：139-147.
[7] 滕中秋，付卉青，贾少华，等.植物应答非生物胁迫的代谢组学研究进展[J].植物生态学报，2011，35（1）：110-118.
[8] TRETYN A，LUKASIEWICZ-RUTKOWSKA H，KOPCEWICZ J.Isolation，purification and identification of acetylcholine in Pharbitis nil seedlings[J].Acta Physiol Plant，1997，19（3）：303-309.
[9] WANT E J，O’MAILLE Q，SMITH C A，et al.Solvent-dependent metabolite distribution，clustering，and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry[J].Anal Chem，2005，78（3）：743-752.
[10] 张晓飞，段礼新，龚月桦，等.用气相色谱-质谱联用比较牛耳草代谢物的提取方法[J].生物工程学报，2014，30（2）：294-304.
[11] 齐晓辉，李红燕，郭守东，等.4种不同来源浒苔中多糖的提取分离及理化性质[J].青岛：中国海洋大学学报（自然科学版），2010，40（5）：15-18.
[12] 徐大伦.浒苔主要化学组分的分析及多糖活性的研究[D].青岛：中国海洋大学 ，2004.
[13] 孙伟红，冷凯良，王志杰，等.浒苔的氨基酸和脂肪酸组成研究[J].渔业科学进展，2009，30（2）：106-114.