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摘要：在经过Ac/Ds基因标签系统获得的水稻Ds插入突变株系中得到1株水稻曲穗突变体植株，对该突变体进行初步表型观察，结果显示，成熟期突变体植株的稻穗有一定的弯曲；同时采用TAIL-PCR方法获得曲穗突变体Ds侧翼基因序列，结果证明含有1个Ds插入位点；对Ds侧翼序列进行分析发现，Ds插入在2个基因之间，其下游是编码类泛素特异性蛋白酶1（Ulp1）的基因，该基因与穗的形成有一定的关联；利用RACE技术扩增Ds插入位点下游基因的cDNA的3′端序列，序列比对发现，Ds插入前后其下游基因序列无变化。预测Ds的插入影响了Ulp1基因的启动子区域，进而影响水稻的花序生长发育形成穗弯曲水稻突变体。本研究结果可能在穗型的遗传及发育以及改良优质高产水稻方面有一定的作用。
关键词：水稻；穗型；遗传；发育；改良；Ulp1；Ac/Ds；3′-RACE技术
中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）11-0026-03
在20世纪五六十年代，我国利用半矮化育种及水稻杂种优势技术，水稻产量有很大的提高，但近年来，水稻产量一直处于停滞不前的状态[2]。株型育种是水稻超高产遗传育种的重要方向，而穗型与水稻株型密切相关，是影响水稻产量的重要因素之一。因而，通过对穗型的研究进而提高水稻产量是很多育种专家所重视的问题。在水稻发育生物学研究及实际农业生产中，与弯曲穗型水稻比较而言，直立穗型能够改善灌浆结实期群体结构，增强抗倒伏性，提高群体生长率等生理生态特性，但大多数的研究只是简单地运用统计学对其性状进行简单考察，对直立穗型和彎曲穗型分子机制方面的研究较少[3-5]。阐明相关穗弯曲与穗直立基因的遗传机理，为水稻育种研究提供参考依据，这也是研究优质高产水稻的未来研究方向。本研究对水稻Ds插入突变株系中出现的曲穗突变体进行表型观察，并扩增Ds侧翼序列进行基因的初步鉴定，在此基础上采用RACE扩增技术扩增Ds标记基因的cDNA序列，分析Ds的插入对水稻穗型变化影响的分子机理。
1材料与方法
1.1材料
曲穗突变体水稻来源于水稻品种Dongjin （Oryza sativa L. var. japonica cv. Dongjin）的Ac/Ds插入突变体系，由韩国国立庆尚大学Han Chang-deok教授实验室提供，委托江苏太湖地区农业科学研究所对种子进行播种并栽培。在生长期期间多次观察其表型，并取田间栽培的野生型与突变体水稻完整植株，带回实验室取其幼嫩的新鲜组织，提取植物基因组DNA和RNA用于后续试验研究。抽穗期间，突变体较野生型水稻抽穗较早并在该期间株高有显著差异；成熟期，突变体与野生型植株穗弯曲程度存在明显差异（图1）。
1.2方法
1.2.1引物设计根据转座子Ds的序列特点，在Ds的3′末端设计引物SP1、SP2、SP3，分别与随机简并引物AD1、AD2搭配，进行TAIL-PCR的3轮扩增；以TAIL-PCR扩增获得的Ds侧翼水稻序列设计3′-RACE扩增特异引物。除了RACE的通用引物外，其他引物均采用Primer Premier 6.0和Oligo 7软件进行设计，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列见表1。
1.2.2突变体水稻Ds侧翼序列的扩增采用TaKaRa植物DNA提取试剂盒，对野生型和突变体水稻的单株叶片DNA进行分离提取；采用核酸微量紫外分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000）对所提取的DNA进行浓度和纯度检测，选取纯度较高的DNA作为后续PCR反应模板；
突变体基因组DNA进行Ac/Ds元件插入检测，确认含有Ds插入后进行Ds侧翼序列扩增；以曲穗突变体基因组作为模板，以随机简并引物AD1和AD2分别与特异引物SP1、SP2、SP3搭配进行TAIL-PCR的3轮反应扩增Ds的侧翼序列；根据引物设计特点，TAIL-PCR的2、3轮反应产物大小应相差36 bp，然后对第3轮反应特异条带进行割胶，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收、纯化特异扩增产物；将其产物连接到PMD19-T Vector进行TA克隆，16 ℃条件下连接过夜；连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞进行蓝白斑筛选，挑取10个单菌落，在LB液体培养基中培养过夜；将菌液PCR验证为阳性克隆的菌液，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定，获得Ds侧翼序列。
1.2.3Ds标记基因cDNA的RACE扩增对野生型和曲穗突变体的不同组织，利用Trizol法提取总RNA。采用TaKaRa公司Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒，建立反转录反应体系，将提取的总RNA反转录为cDNA，将其作为RACE扩增反应的模板。
第1轮RACE反应体系（50 μL）包括5 μL的10×Buffer、3 μL的dNTPs （2.5 mmol/L）、1.5 μL引物US、0.3 μL的引物UL、1.5 μL的1轮特异引物、0.25 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）以及约200 ng cDNA模板。反应循环参数为：94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25个循环。第2轮反应中，以通用引物NUP与第2轮的特异引物搭配，为了得到理想的结果，再以第2轮扩增产物为模板重复第2轮反应。退火温度依据特异引物与NUP的解链温度（Tm）值确定。依据预测的RACE目标条带大小以及2、3轮结果比对，选取第3轮反应中合适的电泳迁移条带，经胶回收、TA克隆后，将菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定。
1.2.4突变体中Ds的染色体定位、插入位点以及Ds标记基因的生物信息学分析将测序获得的Ds侧翼序列与NCBI数据库中序列进行在线比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），确定突变体基因组上Ds的染色体定位和基因位点。将测序获得的cDNA的序列与NCBI数据库中序列进行在线比对，分析Ds插入前、后标记基因的结构。 2结果与分析
2.1曲穗突变体基因组上Ds的插入位点
对曲穗突变体进行基于TAIL-PCR技术的Ds侧翼序列的扩增，结果见图2。以突变体基因组DNA为模板进行扩增获取得到Ds侧翼序列，通过NCBI-BLAST在线比对和分析发现，Ds插入在3号染色体上（Sequence ID：dbj|AP014959.1|），插入在2个基因之间，下游为类泛素特异性蛋白酶1（Ulp1）基因（图3），该基因与穗的形成有一定的关联，由此推测Ds的插入会对下游基因Ulp1的表达有影响。
2.2Ds標记基因cDNA末端序列的分析
TAIL-PCR扩增的Ds侧翼序列分析表明，Ds插入在2个基因之间，但下游基因对穗的形成有关联，以此为基础，提取下游基因相关序列设计2对不同的RACE特异引物，并分别以野生型和曲穗突变体水稻总RNA反转录产生的cDNA为模板进行RACE扩增反应并对其扩增产物进行电泳分析（图4），第1对特异性引物组合RACE1-1和RACE1-2中，曲穗突变体第3轮扩增产物有1条约为400 bp的主条带，第2对特异性引物组合RACE2-1和RACE2-2中，野生型和突变体2、3轮扩增产物都有1条约为800 bp的主条带，经序列测定800 bp左右的条带为特异扩增产物。测序结果显示，Ds插入前后，下游编码Ulp1的基因序列无变化。预测Ds的插入位置对Ulp1基因的启动子结构有一定的影响，有研究表明Ulp1调节SUMO/Smt3代谢途径，而SUMO/Smt3途径对细胞分化及细胞生长、DNA的复制与修复、核蛋白导入和靶向以及植物开花时期有重要作用[6-7]。
3讨论与结论
玉米Ac/Ds双因子系统属于DNA转座元件hAT超家族的成员，近年来运用Ac/Ds双元件系统构建水稻突变体库已经有了很大的进展，日本、美国、韩国、荷兰、澳大利亚等不同的国家都有科学家致力于水稻突变体库的构建，这为高通量突变体筛选、功能基因组学研究以及突变体库的构建和育种奠定了基础。同时，利用水稻基因组中大量的序列信息去阐明基因的生物学功能、鉴定以及克隆相关农艺性状的基因，对改良水稻的生产性能和品质具有重要意义。
穗型是水稻的重要形态特征之一，与水稻产量水平有着密切的联系，是水稻理想株型育种和栽培研究关注的焦点[8]。有研究表明，直立穗型和弯曲穗型在直链淀粉含量、不同部位粒型分布等方面都有区别[9-10]，在实际生产中由于直立穗型群体的实粒数、千粒质量明显高于弯曲穗型群体，特别是直立穗群体的二次枝梗实粒率比弯曲型群体高10%以上，以及直立穗更能充分利用光照条件进行光合作用，更倾向于直立穗型的培育[11]。已有的研究大部分从形态及生理方面着手讨论弯曲穗型与直立穗型的不同点，但弯曲穗型与直立穗型在分子机制方面的差异有待进一步研究。
关于控制水稻穗型基因的研究显示，定位在第2条染色体短臂端nDel标记EJ-4和dCAPs标记EJ-5之间的 FUWA 基因，定位在第6号染色体短臂端SSR标记的Rm253和RM19623之间的EP4基因，定位在9号染色体的qPE9-1基因，在粒长、粒宽、穗弯曲、穗直立等穗型方面进行调控[2，5，12-13]。本研究结果显示，曲穗突变体的Ds插入在2个基因之间，其下游基因为Ulp1的基因，Ds标记基因cDNA末端序列的分析显示曲穗突变体水稻与野生型水稻序列无变化，但表型观察结果证明两者在穗型弯曲度上确实存在差异，Ac/Ds双元件检测也确实有Ds元件的插入，TAIL-PCR结果也证明含有1个Ds的拷贝，说明Ds的插入对突变体穗的形成有影响。Ds插入位置下游基因Ulp1在穗型发育过程中有一定的调节作用。穗型的调控涉及许多不同的生化途径，包括泛素化途径，近年来关于控制穗部性状相关基因陆续被克隆出来，如控制穗型粒宽、粒质量编码E3泛素连接酶的GW2基因可能参与降解促进细胞分裂的蛋白的过程，进而对水稻颖壳、粒质量和产量方面进行控制，如编码核定位蛋白的GW5基因，通过泛素蛋白酶体途径调节控制穗型粒宽、粒质量[14-15]。水稻穗部性状是由多基因控制的复杂的数量性状，另外已经克隆的水稻穗型基因还包括D2、GS3、GS5、GW8、TAW1等基因[16-20]，随着测序技术的发展和分子标记的应用以及突变体的挖掘，已克隆出来的控制穗部性状的基因揭示了粒穗调控的相关机制，也为利用分子育种手段改良品种奠定了一定的基础。但是，Ulp1参与的泛素化调解途径以及在穗型调控的确切机制还有待进一步确认。
另外，本研究对获得的Ulp1基因没有进行表达谱的分析，在后续研究中运用荧光定量PCR技术得到该基因在水稻不同组织的表达差异，进一步分析Ds插入是否会对Ulp1基因的表达产生影响。
参考文献：
[1]刘坚，陶红剑，施思，等. 水稻穗型的遗传和育种改良[J]. 中国水稻科学，2012，26（2）：227-234.
[2]Zhou Y，Zhu J Y，Li Z Y，et al. Deletion in a quantitative trait gene qPE9-1 associated with panicle erectness improves plant architecture during rice domestication[J]. Genetics，2009，183（1）：315-324.
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[4]徐正进，陈温福，周洪飞，等. 直立穗型水稻群体生理生态特性及其利用前景[J]. 科学通报，1996，41（12）：1122-1126. [5]Zhang Y，Zhou J W，Yang Y，et al. A novel gene responsible for erect panicle from Oryza glumaepatula[J]. Euphytica，2015，205（3）：739-745.
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[9]朱海江，程方民，王丰，等. 两种穗型粳稻穗内粒间直链淀粉含量变异与粒位分布特征[J]. 中国水稻科学，2004，18（4）：321-325.
[10]金峰，陈书强，李培培，等. 直立与弯曲穗型水稻穗上不同部位粒形分布特征[J]. 沈阳农业大学学报，2008，39（3）：279-284.
[11]冯永祥，徐正进，谢立勇，等. 水稻穗型对群体光环境及生产影响的模拟研究[J]. 辽宁农业科学，2003（2）：9-11.
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关键词：水稻；穗型；遗传；发育；改良；Ulp1；Ac/Ds；3′-RACE技术
中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）11-0026-03
在20世纪五六十年代，我国利用半矮化育种及水稻杂种优势技术，水稻产量有很大的提高，但近年来，水稻产量一直处于停滞不前的状态[2]。株型育种是水稻超高产遗传育种的重要方向，而穗型与水稻株型密切相关，是影响水稻产量的重要因素之一。因而，通过对穗型的研究进而提高水稻产量是很多育种专家所重视的问题。在水稻发育生物学研究及实际农业生产中，与弯曲穗型水稻比较而言，直立穗型能够改善灌浆结实期群体结构，增强抗倒伏性，提高群体生长率等生理生态特性，但大多数的研究只是简单地运用统计学对其性状进行简单考察，对直立穗型和彎曲穗型分子机制方面的研究较少[3-5]。阐明相关穗弯曲与穗直立基因的遗传机理，为水稻育种研究提供参考依据，这也是研究优质高产水稻的未来研究方向。本研究对水稻Ds插入突变株系中出现的曲穗突变体进行表型观察，并扩增Ds侧翼序列进行基因的初步鉴定，在此基础上采用RACE扩增技术扩增Ds标记基因的cDNA序列，分析Ds的插入对水稻穗型变化影响的分子机理。
1材料与方法
1.1材料
曲穗突变体水稻来源于水稻品种Dongjin （Oryza sativa L. var. japonica cv. Dongjin）的Ac/Ds插入突变体系，由韩国国立庆尚大学Han Chang-deok教授实验室提供，委托江苏太湖地区农业科学研究所对种子进行播种并栽培。在生长期期间多次观察其表型，并取田间栽培的野生型与突变体水稻完整植株，带回实验室取其幼嫩的新鲜组织，提取植物基因组DNA和RNA用于后续试验研究。抽穗期间，突变体较野生型水稻抽穗较早并在该期间株高有显著差异；成熟期，突变体与野生型植株穗弯曲程度存在明显差异（图1）。
1.2方法
1.2.1引物设计根据转座子Ds的序列特点，在Ds的3′末端设计引物SP1、SP2、SP3，分别与随机简并引物AD1、AD2搭配，进行TAIL-PCR的3轮扩增；以TAIL-PCR扩增获得的Ds侧翼水稻序列设计3′-RACE扩增特异引物。除了RACE的通用引物外，其他引物均采用Primer Premier 6.0和Oligo 7软件进行设计，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列见表1。
1.2.2突变体水稻Ds侧翼序列的扩增采用TaKaRa植物DNA提取试剂盒，对野生型和突变体水稻的单株叶片DNA进行分离提取；采用核酸微量紫外分光光度计（Thermo Scientific NanoDrop 2000）对所提取的DNA进行浓度和纯度检测，选取纯度较高的DNA作为后续PCR反应模板；
突变体基因组DNA进行Ac/Ds元件插入检测，确认含有Ds插入后进行Ds侧翼序列扩增；以曲穗突变体基因组作为模板，以随机简并引物AD1和AD2分别与特异引物SP1、SP2、SP3搭配进行TAIL-PCR的3轮反应扩增Ds的侧翼序列；根据引物设计特点，TAIL-PCR的2、3轮反应产物大小应相差36 bp，然后对第3轮反应特异条带进行割胶，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收、纯化特异扩增产物；将其产物连接到PMD19-T Vector进行TA克隆，16 ℃条件下连接过夜；连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞进行蓝白斑筛选，挑取10个单菌落，在LB液体培养基中培养过夜；将菌液PCR验证为阳性克隆的菌液，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定，获得Ds侧翼序列。
1.2.3Ds标记基因cDNA的RACE扩增对野生型和曲穗突变体的不同组织，利用Trizol法提取总RNA。采用TaKaRa公司Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒，建立反转录反应体系，将提取的总RNA反转录为cDNA，将其作为RACE扩增反应的模板。
第1轮RACE反应体系（50 μL）包括5 μL的10×Buffer、3 μL的dNTPs （2.5 mmol/L）、1.5 μL引物US、0.3 μL的引物UL、1.5 μL的1轮特异引物、0.25 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）以及约200 ng cDNA模板。反应循环参数为：94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25个循环。第2轮反应中，以通用引物NUP与第2轮的特异引物搭配，为了得到理想的结果，再以第2轮扩增产物为模板重复第2轮反应。退火温度依据特异引物与NUP的解链温度（Tm）值确定。依据预测的RACE目标条带大小以及2、3轮结果比对，选取第3轮反应中合适的电泳迁移条带，经胶回收、TA克隆后，将菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定。
1.2.4突变体中Ds的染色体定位、插入位点以及Ds标记基因的生物信息学分析将测序获得的Ds侧翼序列与NCBI数据库中序列进行在线比对（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），确定突变体基因组上Ds的染色体定位和基因位点。将测序获得的cDNA的序列与NCBI数据库中序列进行在线比对，分析Ds插入前、后标记基因的结构。 2结果与分析
2.1曲穗突变体基因组上Ds的插入位点
对曲穗突变体进行基于TAIL-PCR技术的Ds侧翼序列的扩增，结果见图2。以突变体基因组DNA为模板进行扩增获取得到Ds侧翼序列，通过NCBI-BLAST在线比对和分析发现，Ds插入在3号染色体上（Sequence ID：dbj|AP014959.1|），插入在2个基因之间，下游为类泛素特异性蛋白酶1（Ulp1）基因（图3），该基因与穗的形成有一定的关联，由此推测Ds的插入会对下游基因Ulp1的表达有影响。
2.2Ds標记基因cDNA末端序列的分析
TAIL-PCR扩增的Ds侧翼序列分析表明，Ds插入在2个基因之间，但下游基因对穗的形成有关联，以此为基础，提取下游基因相关序列设计2对不同的RACE特异引物，并分别以野生型和曲穗突变体水稻总RNA反转录产生的cDNA为模板进行RACE扩增反应并对其扩增产物进行电泳分析（图4），第1对特异性引物组合RACE1-1和RACE1-2中，曲穗突变体第3轮扩增产物有1条约为400 bp的主条带，第2对特异性引物组合RACE2-1和RACE2-2中，野生型和突变体2、3轮扩增产物都有1条约为800 bp的主条带，经序列测定800 bp左右的条带为特异扩增产物。测序结果显示，Ds插入前后，下游编码Ulp1的基因序列无变化。预测Ds的插入位置对Ulp1基因的启动子结构有一定的影响，有研究表明Ulp1调节SUMO/Smt3代谢途径，而SUMO/Smt3途径对细胞分化及细胞生长、DNA的复制与修复、核蛋白导入和靶向以及植物开花时期有重要作用[6-7]。
3讨论与结论
玉米Ac/Ds双因子系统属于DNA转座元件hAT超家族的成员，近年来运用Ac/Ds双元件系统构建水稻突变体库已经有了很大的进展，日本、美国、韩国、荷兰、澳大利亚等不同的国家都有科学家致力于水稻突变体库的构建，这为高通量突变体筛选、功能基因组学研究以及突变体库的构建和育种奠定了基础。同时，利用水稻基因组中大量的序列信息去阐明基因的生物学功能、鉴定以及克隆相关农艺性状的基因，对改良水稻的生产性能和品质具有重要意义。
穗型是水稻的重要形态特征之一，与水稻产量水平有着密切的联系，是水稻理想株型育种和栽培研究关注的焦点[8]。有研究表明，直立穗型和弯曲穗型在直链淀粉含量、不同部位粒型分布等方面都有区别[9-10]，在实际生产中由于直立穗型群体的实粒数、千粒质量明显高于弯曲穗型群体，特别是直立穗群体的二次枝梗实粒率比弯曲型群体高10%以上，以及直立穗更能充分利用光照条件进行光合作用，更倾向于直立穗型的培育[11]。已有的研究大部分从形态及生理方面着手讨论弯曲穗型与直立穗型的不同点，但弯曲穗型与直立穗型在分子机制方面的差异有待进一步研究。
关于控制水稻穗型基因的研究显示，定位在第2条染色体短臂端nDel标记EJ-4和dCAPs标记EJ-5之间的 FUWA 基因，定位在第6号染色体短臂端SSR标记的Rm253和RM19623之间的EP4基因，定位在9号染色体的qPE9-1基因，在粒长、粒宽、穗弯曲、穗直立等穗型方面进行调控[2，5，12-13]。本研究结果显示，曲穗突变体的Ds插入在2个基因之间，其下游基因为Ulp1的基因，Ds标记基因cDNA末端序列的分析显示曲穗突变体水稻与野生型水稻序列无变化，但表型观察结果证明两者在穗型弯曲度上确实存在差异，Ac/Ds双元件检测也确实有Ds元件的插入，TAIL-PCR结果也证明含有1个Ds的拷贝，说明Ds的插入对突变体穗的形成有影响。Ds插入位置下游基因Ulp1在穗型发育过程中有一定的调节作用。穗型的调控涉及许多不同的生化途径，包括泛素化途径，近年来关于控制穗部性状相关基因陆续被克隆出来，如控制穗型粒宽、粒质量编码E3泛素连接酶的GW2基因可能参与降解促进细胞分裂的蛋白的过程，进而对水稻颖壳、粒质量和产量方面进行控制，如编码核定位蛋白的GW5基因，通过泛素蛋白酶体途径调节控制穗型粒宽、粒质量[14-15]。水稻穗部性状是由多基因控制的复杂的数量性状，另外已经克隆的水稻穗型基因还包括D2、GS3、GS5、GW8、TAW1等基因[16-20]，随着测序技术的发展和分子标记的应用以及突变体的挖掘，已克隆出来的控制穗部性状的基因揭示了粒穗调控的相关机制，也为利用分子育种手段改良品种奠定了一定的基础。但是，Ulp1参与的泛素化调解途径以及在穗型调控的确切机制还有待进一步确认。
另外，本研究对获得的Ulp1基因没有进行表达谱的分析，在后续研究中运用荧光定量PCR技术得到该基因在水稻不同组织的表达差异，进一步分析Ds插入是否会对Ulp1基因的表达产生影响。
参考文献：
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[3]Jhala V M，Thaker V S. X-ray computed tomography to study rice （Oryza sativa L.） panicle development[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（21）：6819-6825.
[4]徐正进，陈温福，周洪飞，等. 直立穗型水稻群体生理生态特性及其利用前景[J]. 科学通报，1996，41（12）：1122-1126. [5]Zhang Y，Zhou J W，Yang Y，et al. A novel gene responsible for erect panicle from Oryza glumaepatula[J]. Euphytica，2015，205（3）：739-745.
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