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摘要[目的] 分析比较几种不同的前處理方法对咖啡因含量检测的影响，筛选较优的咖啡因提取方法。[方法]以国标水提取方法为对照，研究乙醇提取、氯仿提取、超声提取和微波提取对咖啡因含量检测的影响，并对较优的提取方法进一步优化。[结果] 与国标水提取方法相比，超声提取方法准确度更高，相对误差更小。进一步对超声提取的前处理时间进行优化发现：超声处理45 min以上的咖啡因提取效率与国标方法相比，没有显著差异。[结论]综合考虑咖啡因提取效率及处理时间，确定超声提取45 min为该试验最优的咖啡因提取前处理方法，该方法操作更简单、耗时更少、精密度更高。
关键词咖啡；咖啡因；超声辅助提取；高效液相色谱
中图分类号S571.2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-110-03
Influence of Different Pretreatment Methods on the Determination of Caffeine Content in Coffee by HPLC
WANG Xianzhi1，HAO Shumei1，WANG Zhihong2，HE Feifei1* （1. School of Agriculture，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650091； 2. Yunnan Sanbiao Nonglin Sci. & Tech. Co.，Ltd，Kunming，Yunnan 650032）
Abstract[Objective] To study the influence of five pretreatment methods on the determination of caffeine content by HPLC， and to screen a superior method for caffeine extraction in coffee. [Method] With national standard of water pretreatment as the control， we studied the influence of ethanol extraction， chloroform extraction， ultrasonic extraction and microwave extraction on the determination of caffeine content in coffee， and further optimized the processing time for the superior pretreatment method.[Result] Compared with national standard of water extraction method，ultrasonic extraction had higher accuracy and less relatively error. Optimization of pretreatment time of ultrasonic extraction showed that the extraction rate of caffeine by ultrasonic extraction had no significant differences with that by national standard method，when the extraction time was greater than 45 min. [Conclusion] Considering the extraction rate of caffeine and treatment time，45 min ultrasonic extraction is the optimal pretreatment method for caffeine extraction. This method is simple，accurate and needs less operation time.
Key wordsCoffee； Caffeine； Ultrasonicassisted extraction； HPLC
咖啡因（caffeine，CAF）又名咖啡碱，是一种生物碱类化合物。研究表明，咖啡因具有刺激中枢神经的作用，对神经系统、心脑血管系统、消化系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有积极作用[1-2]。然而，长期摄入过量咖啡因可能会引起流产、诱发骨质疏松以及高血压、心率失常等心血管系统疾病[3-5]。
咖啡因是衡量咖啡质量的一项重要指标，因此准确测量咖啡中咖啡因的含量十分重要。目前，测定咖啡因的方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、碘量法和重量法等[6-9]，其中常用的方法为高效液相色谱法。传统的HPLC测定前处理方法操作繁琐或涉及氯仿等有害物质，且咖啡因提取率不高，导致重复性差、准确度低。为建立快速准确、安全无毒、操作简便的咖啡因HPLC测定的前处理方法，笔者通过比较现有不同前处理方法下咖啡因测定结果的差异性，选择相对快速简便且安全无毒的前处理方法，并对该方法进行优化。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1咖啡样品与标准品。生咖啡豆收集自云南保山潞江坝，样品经粉碎并过25目筛后待测。准确称取50 mg咖啡因标准品，纯度大于99.8%，编号GBW（E） 100063，精确至0.1 mg，放入100 mL棕色玻璃容量瓶内，加入适量乙醇-水混合液（1∶4），待咖啡因溶解后，再加入乙醇-水混合液定容，制成浓度为0.5 g/L的储备液。 1.1.2主要仪器。Alliance 2695型高效液相色谱仪，配2489型紫外可见检测器。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱为C18型；流动相为甲醇∶水（30∶70，V/V）混合液；流速在0.5～1.5 mL/min；柱温度40 ℃；检测波长272 nm。
1.2.2不同提取方法的比较。咖啡因标准品溶液按照以下不同前处理方法，比较不同处理方法检测咖啡因的准确度，每种处理方法重复6次。
处理①（水提取法，GB 5009.139-2014[7]）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约90 mL水，沸水浴30 min，不时振摇，取出流水冷却1 min，加入 5 g氧化镁，振摇，再放入沸水浴20 min，取出锥形瓶，冷却至室温，将滤液转移至100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，静置，取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理②（乙醇提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL乙醇，沸水浴30 min，不时振摇。取出锥形瓶，冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度。摇匀，静置，取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理③（氯仿提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，先加2～3 mL超纯水，再加50 mL三氯甲烷，加盖摇匀，在超声处理机上萃取5 min，静置30 min，分层，将萃取液移入另一250 mL的锥形瓶中。在试样中再加40 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤。弃去试样，合并2次萃取液。加入5 mL饱和氯化钠和少量无水硫酸钠（至液面无水花），过滤100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗锥形瓶和滤纸2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.0 mL滤液到50 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理④（超声提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL水，超声提取60 min，冷却。将提取液移入100 mL的容量瓶，用水定容至100 mL。取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理⑤（微波提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL提取液（95%乙醇-水为4∶1），摇匀，置于微波炉内，用微波火力为“高”（350 W）作用3 min，将溶液静置，冷却至室温后过滤，滤液移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
1.2.3超声提取时间的优化。称取过25目筛生咖啡粉0.1 g（精确至0.000 1 g），按照“1.2.1”所述处理④（超声提取法）设置超声提取时间优化试验。同时，对上述处理方法进行加标回收率试验。加标回收处理时，添加咖啡因标准品的终浓度为5 mg/mL。
处理A：按照GB 5009.139-2014处理方法；处理B：超声波处理30 min；处理C：超声波处理45 min；处理D：超声波处理60 min。
2结果与分析
2.1咖啡因色谱图及标准曲线对咖啡因标准品进行HPLC检测，得到标准品的咖啡因色谱图（图1），咖啡因的保留时间约为7.3 min。以样品浓度x（mg/L）对峰面积y求出回归方程并绘制标准曲线。咖啡因标准曲线方程为：y=30 962x-251.8，相关系数r2=0.999 4。圖1咖啡因标准品的咖啡因色谱
Fig. 1Chromatogram of caffeine in coffee standard sample2.2不同提取方法的比较该研究中，处理②（乙醇提取法）未能获得结果，处理⑤（微波提取法）测得的咖啡因标准品浓度太低（低于3 mg/L），所以不纳入不同前处理方法的比较。由表1可知，与处理①（国标）相比，处理④（超声提取法）的RSD和相对误差更小，精密度更高，因此选择处理④（超声提取法）作为该试验的备选方法。
2.3不同超声处理时间对咖啡因提取效果的影响方差分析表明，不同超声处理时间对咖啡因的提取效果存在显著影响（表2）。超声处理45 min以上的咖啡因提取效果与国标方法
3结论与讨论
该研究拟通过比较国标水提取法（GB 5009.139-2014）、乙醇提取法、氯仿提取法、超声提取法和微波提取法5种前处理方法对咖啡中咖啡因含量检测的影响，从而建立准确、快速、安全的咖啡因提取测定方法。研究表明，除乙醇提取法没有获得结果及微波提取法提取效率太低外，其他3种前处理的咖啡因提取检测方法均得出有效结果。与国标水提取方法相比，超声提取方法准确度更高，相对误差更小，且检测过程中不涉及氯仿等有害药品，因此是更为理想的咖啡因提取前处理方法。
进一步对超声提取的前处理时间进行优化表明，超声处理45 min以上的咖啡因提取效率与国标方法相比没有存在显著差异；不同超声处理时长的加标回收率比较表明，超声提取法可以获得比国标水提取法更高的加标回收率。因此，综合考虑提取效率及处理时间，该试验确定超声提取45 min为最优的咖啡因提取方法。和国标方法相比，45 min超声前处理咖啡因提取产量差异不显著且用时更少，同时该方法操作更简单、精密度高，可以作为今后咖啡因含量检测的参考方法。
参考文献
[1] 韩洪波，杨春琳，李敏杰. HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量[J].食品研究与开发，2013，34（6）：85-88. [2] 宋爽，黄业伟，王宣军，等.低pH沉淀法检测茶中的结合咖啡因[J]. 茶叶科学，2013，33（4）：276-282.
[3] RAPURI P B，GALLAGHER J C，KINYAMU H K，et al. Caffeine intake increases the rate of bone loss in elderly women and interacts with vitamin D receptor genotypes[J]. American journal of clinical nutrition，2001，74（5）：694-700.
[4] GROSSO L M，BRACKEN M B. Caffeine metabolism，genetics，and perinatal outcomes：A review of exposure assessment considerations during pregnancy[J]. Annals of epidemiology，2005，15（6）：460-466.
[5] DUARTE P M，MARQUES M R，BEZERRA J P，et al. The effects of caffeine administration on the early stage of bone healing and bone density [J]. Archives of oral biology，2009，54（8）：717-722.
[6] 鄒冬梅，袁宏球，吴琼，等. 咖啡及其制品中咖啡因HPLC测定的前处理方法研究[J].热带作物学报，2014，35（1）：176-182.
[7] 国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准-饮料中咖啡因的测定：GB 5009.139-2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[8] 李蔚，苏黎，陈金东.食品中咖啡因含量的测定方法[J].中国卫生检验杂志，2008，18（11）：2194-2196.
[9] 董悦涵.高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量研究[J].现代农业科技，2012（6）：280-281.安徽农业科学2016年
关键词咖啡；咖啡因；超声辅助提取；高效液相色谱
中图分类号S571.2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-110-03
Influence of Different Pretreatment Methods on the Determination of Caffeine Content in Coffee by HPLC
WANG Xianzhi1，HAO Shumei1，WANG Zhihong2，HE Feifei1* （1. School of Agriculture，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650091； 2. Yunnan Sanbiao Nonglin Sci. & Tech. Co.，Ltd，Kunming，Yunnan 650032）
Abstract[Objective] To study the influence of five pretreatment methods on the determination of caffeine content by HPLC， and to screen a superior method for caffeine extraction in coffee. [Method] With national standard of water pretreatment as the control， we studied the influence of ethanol extraction， chloroform extraction， ultrasonic extraction and microwave extraction on the determination of caffeine content in coffee， and further optimized the processing time for the superior pretreatment method.[Result] Compared with national standard of water extraction method，ultrasonic extraction had higher accuracy and less relatively error. Optimization of pretreatment time of ultrasonic extraction showed that the extraction rate of caffeine by ultrasonic extraction had no significant differences with that by national standard method，when the extraction time was greater than 45 min. [Conclusion] Considering the extraction rate of caffeine and treatment time，45 min ultrasonic extraction is the optimal pretreatment method for caffeine extraction. This method is simple，accurate and needs less operation time.
Key wordsCoffee； Caffeine； Ultrasonicassisted extraction； HPLC
咖啡因（caffeine，CAF）又名咖啡碱，是一种生物碱类化合物。研究表明，咖啡因具有刺激中枢神经的作用，对神经系统、心脑血管系统、消化系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有积极作用[1-2]。然而，长期摄入过量咖啡因可能会引起流产、诱发骨质疏松以及高血压、心率失常等心血管系统疾病[3-5]。
咖啡因是衡量咖啡质量的一项重要指标，因此准确测量咖啡中咖啡因的含量十分重要。目前，测定咖啡因的方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、碘量法和重量法等[6-9]，其中常用的方法为高效液相色谱法。传统的HPLC测定前处理方法操作繁琐或涉及氯仿等有害物质，且咖啡因提取率不高，导致重复性差、准确度低。为建立快速准确、安全无毒、操作简便的咖啡因HPLC测定的前处理方法，笔者通过比较现有不同前处理方法下咖啡因测定结果的差异性，选择相对快速简便且安全无毒的前处理方法，并对该方法进行优化。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1咖啡样品与标准品。生咖啡豆收集自云南保山潞江坝，样品经粉碎并过25目筛后待测。准确称取50 mg咖啡因标准品，纯度大于99.8%，编号GBW（E） 100063，精确至0.1 mg，放入100 mL棕色玻璃容量瓶内，加入适量乙醇-水混合液（1∶4），待咖啡因溶解后，再加入乙醇-水混合液定容，制成浓度为0.5 g/L的储备液。 1.1.2主要仪器。Alliance 2695型高效液相色谱仪，配2489型紫外可见检测器。
1.2方法
1.2.1色谱条件。色谱柱为C18型；流动相为甲醇∶水（30∶70，V/V）混合液；流速在0.5～1.5 mL/min；柱温度40 ℃；检测波长272 nm。
1.2.2不同提取方法的比较。咖啡因标准品溶液按照以下不同前处理方法，比较不同处理方法检测咖啡因的准确度，每种处理方法重复6次。
处理①（水提取法，GB 5009.139-2014[7]）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约90 mL水，沸水浴30 min，不时振摇，取出流水冷却1 min，加入 5 g氧化镁，振摇，再放入沸水浴20 min，取出锥形瓶，冷却至室温，将滤液转移至100 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，静置，取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理②（乙醇提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL乙醇，沸水浴30 min，不时振摇。取出锥形瓶，冷却至室温，转移至100 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度。摇匀，静置，取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理③（氯仿提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，先加2～3 mL超纯水，再加50 mL三氯甲烷，加盖摇匀，在超声处理机上萃取5 min，静置30 min，分层，将萃取液移入另一250 mL的锥形瓶中。在试样中再加40 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤。弃去试样，合并2次萃取液。加入5 mL饱和氯化钠和少量无水硫酸钠（至液面无水花），过滤100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗锥形瓶和滤纸2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.0 mL滤液到50 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理④（超声提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL水，超声提取60 min，冷却。将提取液移入100 mL的容量瓶，用水定容至100 mL。取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
处理⑤（微波提取法）：准确吸取0.8 mL咖啡因储备液于250 mL锥形瓶中，加入约100 mL提取液（95%乙醇-水为4∶1），摇匀，置于微波炉内，用微波火力为“高”（350 W）作用3 min，将溶液静置，冷却至室温后过滤，滤液移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容。取10 mL滤液通过混纤微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，弃去最初的5 mL，保留后5 mL备用。
1.2.3超声提取时间的优化。称取过25目筛生咖啡粉0.1 g（精确至0.000 1 g），按照“1.2.1”所述处理④（超声提取法）设置超声提取时间优化试验。同时，对上述处理方法进行加标回收率试验。加标回收处理时，添加咖啡因标准品的终浓度为5 mg/mL。
处理A：按照GB 5009.139-2014处理方法；处理B：超声波处理30 min；处理C：超声波处理45 min；处理D：超声波处理60 min。
2结果与分析
2.1咖啡因色谱图及标准曲线对咖啡因标准品进行HPLC检测，得到标准品的咖啡因色谱图（图1），咖啡因的保留时间约为7.3 min。以样品浓度x（mg/L）对峰面积y求出回归方程并绘制标准曲线。咖啡因标准曲线方程为：y=30 962x-251.8，相关系数r2=0.999 4。圖1咖啡因标准品的咖啡因色谱
Fig. 1Chromatogram of caffeine in coffee standard sample2.2不同提取方法的比较该研究中，处理②（乙醇提取法）未能获得结果，处理⑤（微波提取法）测得的咖啡因标准品浓度太低（低于3 mg/L），所以不纳入不同前处理方法的比较。由表1可知，与处理①（国标）相比，处理④（超声提取法）的RSD和相对误差更小，精密度更高，因此选择处理④（超声提取法）作为该试验的备选方法。
2.3不同超声处理时间对咖啡因提取效果的影响方差分析表明，不同超声处理时间对咖啡因的提取效果存在显著影响（表2）。超声处理45 min以上的咖啡因提取效果与国标方法
3结论与讨论
该研究拟通过比较国标水提取法（GB 5009.139-2014）、乙醇提取法、氯仿提取法、超声提取法和微波提取法5种前处理方法对咖啡中咖啡因含量检测的影响，从而建立准确、快速、安全的咖啡因提取测定方法。研究表明，除乙醇提取法没有获得结果及微波提取法提取效率太低外，其他3种前处理的咖啡因提取检测方法均得出有效结果。与国标水提取方法相比，超声提取方法准确度更高，相对误差更小，且检测过程中不涉及氯仿等有害药品，因此是更为理想的咖啡因提取前处理方法。
进一步对超声提取的前处理时间进行优化表明，超声处理45 min以上的咖啡因提取效率与国标方法相比没有存在显著差异；不同超声处理时长的加标回收率比较表明，超声提取法可以获得比国标水提取法更高的加标回收率。因此，综合考虑提取效率及处理时间，该试验确定超声提取45 min为最优的咖啡因提取方法。和国标方法相比，45 min超声前处理咖啡因提取产量差异不显著且用时更少，同时该方法操作更简单、精密度高，可以作为今后咖啡因含量检测的参考方法。
参考文献
[1] 韩洪波，杨春琳，李敏杰. HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量[J].食品研究与开发，2013，34（6）：85-88. [2] 宋爽，黄业伟，王宣军，等.低pH沉淀法检测茶中的结合咖啡因[J]. 茶叶科学，2013，33（4）：276-282.
[3] RAPURI P B，GALLAGHER J C，KINYAMU H K，et al. Caffeine intake increases the rate of bone loss in elderly women and interacts with vitamin D receptor genotypes[J]. American journal of clinical nutrition，2001，74（5）：694-700.
[4] GROSSO L M，BRACKEN M B. Caffeine metabolism，genetics，and perinatal outcomes：A review of exposure assessment considerations during pregnancy[J]. Annals of epidemiology，2005，15（6）：460-466.
[5] DUARTE P M，MARQUES M R，BEZERRA J P，et al. The effects of caffeine administration on the early stage of bone healing and bone density [J]. Archives of oral biology，2009，54（8）：717-722.
[6] 鄒冬梅，袁宏球，吴琼，等. 咖啡及其制品中咖啡因HPLC测定的前处理方法研究[J].热带作物学报，2014，35（1）：176-182.
[7] 国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准-饮料中咖啡因的测定：GB 5009.139-2014[S].北京：中国标准出版社，2014.
[8] 李蔚，苏黎，陈金东.食品中咖啡因含量的测定方法[J].中国卫生检验杂志，2008，18（11）：2194-2196.
[9] 董悦涵.高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量研究[J].现代农业科技，2012（6）：280-281.安徽农业科学2016年