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【摘要】 目的：探索蛋白免疫印迹技术关键步骤的改良方法。方法：以小鼠为研究对象，采用改良的蛋白免疫技术分析小鼠肝脏CYP1A1的表达水平。结果：不仅缩短实验时间，而且获得的目标条带清晰，非特异性的本底显色浅。结论：改良的蛋白免疫印迹技术一定程度上能够很好的分离目标蛋白，降低本底，获得比较满意的实验结果，有利于对蛋白质的进一步分析研究。
蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，具有敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质表达的一种最常用的分子生物学技术方法，目前已广泛运用在医学各类学科研究中，但其存在操作步骤复杂，操作不易掌握的缺点。在多年指导研究生western blotting教学实验中，针对western-blotting实验主要步骤进行优化改良，取得较好的结果，现总结如下。
1 材料和方法
1.1 材料 小鼠购于贵阳医学院实验动物中心，雄性，体重在30g左右。小鼠抗小鼠CYP1A1一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗购于santa cruz biotehnology公司,丙烯酰胺购于amresco公司，甲叉丙烯酰胺购于american biotec公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于TIANGEN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鼠肝组织蛋白质的提取及浓度测定 剖鼠取肝加入裂解缓冲液制备肝匀浆，20000g、4℃离心30分钟取上清分装，-30℃冻存。采用BCA方法测定蛋白浓度。
1.2.2 western blotting实验 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 取 45 μg 蛋白与等体积2倍上样Buffer混匀后，100℃变性10 min。蛋白样品进行不连续SDS-PAGE分离，5%浓缩胶、12%分离胶。80 V电泳，待条带迁移至分离胶上缘时再延长2分钟调整为120 V电泳。（2）转膜 NC膜用转移缓冲液浸泡30 min以上，采用湿转法进行电转移，200 mA，60 min。（3）封闭 NC膜置于封闭液中，37℃孵育2 h，每20分钟置于脱色摇床上轻轻摇动封闭10分钟。（4）一抗孵育 抗CYP1A1一抗（1:400稀释）4℃孵育2 h，每30小时置于摇床上摇动10分钟。然后用洗涤缓冲液摇床摇动洗膜两次，每次7 min。（5）二抗孵育 二抗（1：2000 稀释），同上述方法室温孵育1 h，洗膜。（6）显色 DAB显色法。（7）图像的采集与分析 用凝胶成像分析系统照相观察结果并记录。
2 结果
采用改良的蛋白免疫印迹技术检测小鼠肝组织CYP1A1蛋白表达水平的结果见图1。从图中可见49-62KD之间出现分子量为56KD的目标条带，目标条带清晰，各泳道彼此分离，背景干净，基本未见非特异性条带，无拖尾现象。
图1 改良的Western blotting检测鼠肝中CYP1A1的表达
M：彩色预染的分子量标准
1-12：不同实验组CYP1A1蛋白表达水平
3 讨论
在常规的蛋白免疫印迹技术的基础上，摸索了一套针对关键步骤的改良方案，主要包括以下几个方面：一、制胶阶段：实验前一天灌分离胶、积聚胶，凝胶的过程置于37℃，两种胶凝固后立即用双层保鲜膜密封置于4℃冰箱过夜，以便获得凝固均匀的积聚胶、分离胶，提高积聚胶压缩及分离胶分离的效果。另外为了得到整齐的目标电泳条带，积聚胶的长度应适当加长；二、上样阶段：尽可能的缩短上样时间，防止最先上样的样品出现弥散现象；三、电泳阶段：样品跑完积聚胶后，延长2分钟左右再换电压，然后根据溴酚兰及彩色预染分子量标准的指示，判断目标条带在分离胶的中1∕3位置，停止电泳，这样有利于获得相对整齐、清晰的目标条带；四、转膜阶段：制备“三明治”的过程在预先准备的4℃转移缓冲液中进行，不仅方便操作，而且还避免气泡进入。转膜的过程在4℃环境中进行，防止温度过高，对膜有影响。不同分子量的蛋白质需要摸索具体的转膜电压及时间；五、封闭阶段：经过摸索不同的温度，发现放置于37℃环境下，封闭非特异条带的效果最好，最好封闭过夜；五、抗体的孵育：一抗二抗孵育的温度在4℃左右，可以有效的减少本底。如果购买一抗的时间超过一年最好孵育过夜，防止抗体效价降低影响结果。购买不足一年的孵育2个小时即可，以免增加非特异性条带；六、洗涤阶段：摇床摇动洗涤仅需要2次，每次7分钟。经过反复实践证明，经过对上述关键步骤的改良，不仅缩短反应的时间使整个过程在15小时内完成，而且得到的目标条带清晰，本底干净，值得大家借鉴。
参考文献
［1］郭春燕,詹克慧.蛋白质组学技术研究进展及应用[J].云南农业大学学报,2010,25(4):583-591.
［2］Kurien B T, Scofield R H. Introduction to protein blotting[J].Methods Mol Biol, 2009, 536:9-22.
［3］赵海豹,林汝仙,王升启.蛋白质组学研究相关技术及进展[J].生物技术通讯,2008,19(6):903-906.
［4］范培昌，1989.生物大分子印迹技术.上海:上海科技文献出版社.28-35.
蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，具有敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质表达的一种最常用的分子生物学技术方法，目前已广泛运用在医学各类学科研究中，但其存在操作步骤复杂，操作不易掌握的缺点。在多年指导研究生western blotting教学实验中，针对western-blotting实验主要步骤进行优化改良，取得较好的结果，现总结如下。
1 材料和方法
1.1 材料 小鼠购于贵阳医学院实验动物中心，雄性，体重在30g左右。小鼠抗小鼠CYP1A1一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗购于santa cruz biotehnology公司,丙烯酰胺购于amresco公司，甲叉丙烯酰胺购于american biotec公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于TIANGEN公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鼠肝组织蛋白质的提取及浓度测定 剖鼠取肝加入裂解缓冲液制备肝匀浆，20000g、4℃离心30分钟取上清分装，-30℃冻存。采用BCA方法测定蛋白浓度。
1.2.2 western blotting实验 （1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 取 45 μg 蛋白与等体积2倍上样Buffer混匀后，100℃变性10 min。蛋白样品进行不连续SDS-PAGE分离，5%浓缩胶、12%分离胶。80 V电泳，待条带迁移至分离胶上缘时再延长2分钟调整为120 V电泳。（2）转膜 NC膜用转移缓冲液浸泡30 min以上，采用湿转法进行电转移，200 mA，60 min。（3）封闭 NC膜置于封闭液中，37℃孵育2 h，每20分钟置于脱色摇床上轻轻摇动封闭10分钟。（4）一抗孵育 抗CYP1A1一抗（1:400稀释）4℃孵育2 h，每30小时置于摇床上摇动10分钟。然后用洗涤缓冲液摇床摇动洗膜两次，每次7 min。（5）二抗孵育 二抗（1：2000 稀释），同上述方法室温孵育1 h，洗膜。（6）显色 DAB显色法。（7）图像的采集与分析 用凝胶成像分析系统照相观察结果并记录。
2 结果
采用改良的蛋白免疫印迹技术检测小鼠肝组织CYP1A1蛋白表达水平的结果见图1。从图中可见49-62KD之间出现分子量为56KD的目标条带，目标条带清晰，各泳道彼此分离，背景干净，基本未见非特异性条带，无拖尾现象。
图1 改良的Western blotting检测鼠肝中CYP1A1的表达
M：彩色预染的分子量标准
1-12：不同实验组CYP1A1蛋白表达水平
3 讨论
在常规的蛋白免疫印迹技术的基础上，摸索了一套针对关键步骤的改良方案，主要包括以下几个方面：一、制胶阶段：实验前一天灌分离胶、积聚胶，凝胶的过程置于37℃，两种胶凝固后立即用双层保鲜膜密封置于4℃冰箱过夜，以便获得凝固均匀的积聚胶、分离胶，提高积聚胶压缩及分离胶分离的效果。另外为了得到整齐的目标电泳条带，积聚胶的长度应适当加长；二、上样阶段：尽可能的缩短上样时间，防止最先上样的样品出现弥散现象；三、电泳阶段：样品跑完积聚胶后，延长2分钟左右再换电压，然后根据溴酚兰及彩色预染分子量标准的指示，判断目标条带在分离胶的中1∕3位置，停止电泳，这样有利于获得相对整齐、清晰的目标条带；四、转膜阶段：制备“三明治”的过程在预先准备的4℃转移缓冲液中进行，不仅方便操作，而且还避免气泡进入。转膜的过程在4℃环境中进行，防止温度过高，对膜有影响。不同分子量的蛋白质需要摸索具体的转膜电压及时间；五、封闭阶段：经过摸索不同的温度，发现放置于37℃环境下，封闭非特异条带的效果最好，最好封闭过夜；五、抗体的孵育：一抗二抗孵育的温度在4℃左右，可以有效的减少本底。如果购买一抗的时间超过一年最好孵育过夜，防止抗体效价降低影响结果。购买不足一年的孵育2个小时即可，以免增加非特异性条带；六、洗涤阶段：摇床摇动洗涤仅需要2次，每次7分钟。经过反复实践证明，经过对上述关键步骤的改良，不仅缩短反应的时间使整个过程在15小时内完成，而且得到的目标条带清晰，本底干净，值得大家借鉴。
参考文献
［1］郭春燕,詹克慧.蛋白质组学技术研究进展及应用[J].云南农业大学学报,2010,25(4):583-591.
［2］Kurien B T, Scofield R H. Introduction to protein blotting[J].Methods Mol Biol, 2009, 536:9-22.
［3］赵海豹,林汝仙,王升启.蛋白质组学研究相关技术及进展[J].生物技术通讯,2008,19(6):903-906.
［4］范培昌，1989.生物大分子印迹技术.上海:上海科技文献出版社.28-35.