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摘 要：针对降解高毒、高危害的尼古丁微生物种类较少的实际情况筛选出具有高尼古丁降解活性的菌株，探究其降解条件及降解特性，为尼古丁的生物降解提供新的微生物资源。从烟草种植大田土壤分离纯化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株，对其形态学、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性进行了分析鉴定，探究了不同条件下尼古丁降解特性并对其动态降解过程进行了HPLC分析。经鉴定命名为Stenotrophomonas sp. ZUC-3，适宜的发酵条件为：温度30 ℃、起始pH 7.0、接种量10%、培养转速180 r/min，此条件下尼古丁降解率可达到91.53%，HPLC分析显示了ZUC-3降解尼古丁过程的动态变化及其高效性。研究结果为尼古丁生物降解提供了新的微生物资源，对烟草行业可持续发展具有理论意义与实际应用价值。
关键词：尼古丁;生物降解;Stenotrophomonas sp. ZUC-3;降解特性
中图分类号：TS41+1 文章编号：1007-5119（2019）01-0089-09 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.012
Abstract： The aim of this study was to isolate and identify a strain with high nicotine degradation activity in the situation where there are few kinds of nicotine-degrading microorganisms available， and to explore the conditions and characteristics of nicotine degradation， which will provide a new microbiological resource for the biodegradation of nicotine. A strain with high activity of nicotine degradation was obtained by isolation and purification from tobacco field soil. The strain was identified by morphological， physio-biochemical and 16S rRNA gene analysis， and the characteristics of nicotine degradation under different conditions were investigated with dynamic process by HPLC analysis. The optimum condition of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 was 30 ℃ with 10% inoculum at the initial pH 7.0 and 180 r/min， in which the rate of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 reached 91.53%. HPLC analysis illustrated the dynamic process and high efficiency of nicotine degradation. The study provides a new microbiological resource for biodegradation of nicotine and has theoretical and practical significance in tobacco industry.
Keywords： nicotine; biodegradation; Stenotrophomonas sp. ZUC-3; degradation characteristics
尼古丁（Nicotine）具有高毒性，可透過生物膜，化学结构稳定不易降解[1]，并且是致癌物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）的重要前体物[2]，由于其特殊的水溶性，能够与水以任意比例互溶，对人类生活及生态环境是一个极大的威胁[3]。我国作为世界上最大的烟草种植和加工生产的国家，在生产过程中产生大量含高浓度尼古丁的烟草加工废弃物[4]，所以环境中尼古丁的高效降解是目前一个亟待解决的问题。
微生物在自然环境下尼古丁的降解中扮演着极其重要的角色，YAO等[5]于烟草废弃物中分离出一株具有尼古丁降解能力的菌株，经鉴定为节杆菌属Arthrobacter sp. M2012083，通过对其基因组测序，预测了尼古丁代谢关键基因pAO1，但并未发现编码于质粒上的代谢功能基因。CHEN等[6]于烟草种植土壤中分离并鉴定出一株具有尼古丁降解性能的假单胞菌Pseudomonas sp. Nic22，并对其降解条件进行探究，结果表明，在30～34 ℃、pH 6.5条件下，48 h内可降解2 g/L的尼古丁。YUAN等[7]从烟草种植土壤中分离并鉴定出一株尼古丁降解菌中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium DN2，研究结果表明，该菌株降解尼古丁的最佳条件为30～37 ℃、pH 6.5，平均降解速率为140.5 mg/（L·h）。MENG等[8]于烟草叶片中分离并鉴定出一株具有尼古丁降解能力的曲霉属真菌Aspergillus oryzae 112822，结果表明，在28 ℃、pH 6.5条件下培养40 h后，该菌株的最高生长量为3.6 g/L，最高尼古丁降解量为2.19 g/L。生物降解相对于物理和化学降解过程，具有低成本、高效性、高选择性、环境友好等优势[9]，而且尼古丁降解微生物可将尼古丁转化为多种可再生的功能性中间代谢产物，例如生成的吡啶可作为前体物产生具有高医用价值的药物，也可作为高效安全的杀虫剂应用于生物防治领域[10-11]，过程简便可控，已成为当前研究的热点领域，具有良好的应用前景。 目前已报道的尼古丁降解微生物种类较为单一[12-14]，主要集中在节杆菌属[15-16]（Arthrobacter sp.）、根癌农杆菌[17-18]（Agrobacterium tumefaciens）、假单胞菌属[19-21]（Pseudomonas sp.）、苍白杆菌属[22]（Ochrobactrum sp.）、芽孢杆菌[21]（Bacillus thuringiensis）及某些真菌[22]。不同菌种对尼古丁降解的途径也不同，目前研究比较清楚的是以节杆菌为代表的吡啶途径[25]和以假单胞菌为代表的吡咯途径[26]。除此之外，某些烟草内生真菌具有特殊的尼古丁降解途径，但具体机制尚不清楚。
本研究从烟田土壤取样，分离出一株新的高活性尼古丁降解菌，并对其形态学、生理生化特性、16S rRNA基因序列进行分析鉴定，探究其降解特性，旨在为尼古丁生物降解领域微生物资源的开发与应用提供理论依据与技术指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
土壤样品：采自湖南省郴州市烟草种植基地。
1.2 培养基
Luria-Bertani（LB）培养基：NaCL 10.0 g/L，胰蛋白胨 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，溶解于蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。
尼古丁培养基：K2HPO4 13.30 g/L，KH2PO4 4.00 g/L，（NH4）2SO4 0.01 g/L，酵母粉1.00 g/L，尼古丁2.00 g/L;微量元素溶液10.00 mL（MgSO4·7H2O 1.00 g，MnSO4·H2O 0.40 g，CaCl2 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.20 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，用0.10 mol/L HCL溶解至100 mL），溶解于蒸餾水中，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。
尼古丁固体培养基：同尼古丁培养基，加入1.8%的琼脂即可。
1.3 仪器与设备
SW-CJ-1F型超净工作台：苏州净化设备有限公司;SYQ-DS2X-280B高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂;UV-2600紫外分光光度计：日本岛津公司;HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂;GHP-9160恒温培养箱：上海一恒科技有限公司;SI-0246漩涡混合仪：美国Scientific Industries公司;T100 PCR仪：美国Bio-Rad公司;Avanti J-25高速冷冻离心机：美国Beckman Coulter有限公司;JY3000C电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司;JCM-6000 Plus台式SEM扫描电镜：日本电子株式会社（JEOL）;Agilent1200高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司等。
1.4 方法
1.4.1 尼古丁降解菌的筛选与分离 取5 g土壤样品于95 mL带玻璃珠的无菌生理盐水中，30 ℃、180 r/min振荡20 min，静置5 min后取土壤菌悬液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布于尼古丁固体培养基，于30 ℃培养，定期观察，采用平板划线法多次分离纯化，挑取初筛的单菌落接种于尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养2～3 d，定时取样，测定发酵液尼古丁浓度及菌体生长量，选取降解情况最佳的菌株为目的菌株。
1.4.2 菌种鉴定 形态结构：将纯化后的目的菌种接种于固体尼古丁培养基上，30 ℃培养18～24 h后观察菌落形态，染色镜检观察菌体基本生理特征，扫描电子显微镜（SEM）观察菌体形态。
生理生化特征：生理生化指标的测定及方法参考《常见细菌系统鉴定手册》[28]。
16S rRNA基因序列同源性分析：（1）将目的菌株于30 ℃、180 r/min培养18 h作为种子液，然后按5%接种量转接于新鲜尼古丁培养基中培养24 h。使用Axygen细菌基因组DNA制备试剂盒，按照标准方法提取基因组DNA。（2）以提取的目的基因组DNA为模板，16S rRNA通用引物进行PCR扩增，反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR 扩增片段。（3）取纯化后的PCR产物进行DNA序列测定，将序列结果进行多序列比对并构建系统发育树。
1.4.3 菌株ZUC-3的降解特性试验 将种子液接入装液量为100 mL/250 mL的尼古丁培养基中，设置不同温度：25、30、37 ℃;不同pH：4、5、6、7、8、9、10;不同初始尼古丁浓度：1、2、3、4、5、6、7、8 g/L;不同接种量：5%、10%、15%;不同发酵方式：静置、120 r/min、180 r/min，定时取样，连续测定降解情况，探究温度、pH、接种量、初始尼古丁浓度、转速对ZUC-3降解尼古丁的影响。
1.4.4 ZUC-3降解尼古丁的HPLC检测 将种子液以10%的接种量接入尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，发酵液12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 ?m无菌滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：检测波长为259 nm，色谱柱为C18柱（4.6×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇（色谱纯）：水（1 mmol/L H2SO4）=10∶90，柱温30 ℃，流速0.6 mL/min，进样量20 ?L。
1.5 测定指标及方法
尼古丁浓度测定：尼古丁在波长为259 nm处
存在吸收峰，采用紫外分光光度法测定尼古丁浓度。 将菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，发酵液离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃）后，测定在259 nm处的吸光值。
菌体生长量测定：将菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，采用紫外分光光度法测定菌体生长量，测定在600 nm处的吸光度，以OD600表示。
1.6 数据处理
每个处理均设置3个重复，采用SPSS 20.0和R 3.5.0进行数据统计和分析。
2 结 果
2.1 尼古丁降解菌ZUC-3的分离及对尼古丁降解作用
将ZUC-3以5%的接种量接入尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养48 h后，测定吸收光谱，结果如图1所示，对照组（CK）在259 nm存在吸收峰，接入ZUC-3菌株发酵48 h处理吸收峰消失，表明ZUC-3具有尼古丁降解能力。发酵液颜色在降解过程中也发生明显变化：初期没有发生颜色变化，当培养至12 h左右发酵液颜色开始变绿，随着时间增加颜色逐渐变深呈墨绿色，24 h左右墨绿色开始褪去，发酵液颜色变为深褐色，这与目前已报道的微生物降解尼古丁过程中的发酵液颜色变化有所不同，表明尼古丁降解过程中生成的中间产物可能不同。
2.2 ZUC-3菌种鉴定
2.2.1 形态学特征 ZUC-3在尼古丁固体培养基上，菌落形态初期较小，颜色通透，圆形，中间凸起，表面光滑，四周平滑无隆起，色泽湿润光亮（图2a）;当培养至一周左右，菌落变大，呈米黄色，不透明，圆形，表面光滑，中间突起，四周略微有隆起（图2b）;当培养至2～3周，菌落呈暗褐色（图2c），可能是ZUC-3在尼古丁降解过程中产生的有色代谢产物。SEM电镜结果显示菌体结构呈杆状，无鞭毛，大小为（2.1～2.3） ?m×（0.7～0.9） ?m（图2d）。
2.2.2 生理生化特征 ZUC-3为革兰氏阴性菌，无芽孢，好氧、运动，生长温度范围为4～39 ℃，pH生长范围为5～11。可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等碳源，发酵产酸缓慢或不产，能够还原硝酸盐，水解明胶，DNase、脂酶试验呈阳性，氧化酶、V-P、吲哚、甲基红、H2S、柠檬酸盐试验均呈阴性。
2.2.3 16S rRNA基因序列同源性分析 尼古丁降解菌ZUC-3的16S rRNA基因序列长度为1450 bp，将序列结果提交至GenBank，获得登录号MH 183291，用BLAST工具进行序列相似性比较，随机选取同源性较高的序列，进行多序列比对，构建系统发育树（图3），结果显示ZUC-3与Stenotrophomonas分枝较近。基于对尼古丁降解菌
ZUC-3的形态学、生理生化特征以及16S rRNA基因序列同源性分析，初步确定ZUC-3为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），命名为Stenotrophomonas sp. ZUC-3，该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018346。
2.3 Stenotrophomonas sp. ZUC-3的降解特性
2.3.1 寡养单胞菌ZUC-3生长与尼古丁降解的关系 将ZUC-3以5%接种量接种于新鲜尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养，定时取样，连续测定降解过程中尼古丁浓度的变化及ZUC-3的生长情况，结果如图4所示。菌株ZUC-3在0～12 h处于延滞期，生长较为缓慢，尼古丁降解缓慢;12～24 h，ZUC-3进入指数生长期，菌体生长速率最大，此时尼古丁降解速率也达到最大;30 h左右，ZUC-3生长量达到最大值，此时发酵液中尼古丁浓度降到0.45 g/L，降解率为78%;随后进入稳定期，尼古丁不断降解，48 h时发酵液中尼古丁已降至0.17 g/L，降解率达到91%，表明菌株ZUC-3对尼古丁具有高效降解的能力，菌体生长与尼古丁降解同步。
2.3.2 温度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同温度对ZUC-3降解尼古丁的影响如图5
所示，温度对ZUC-3降解尼古丁（图5a）及生长（图5b）的影响显著，30 ℃时ZUC-3降解尼古丁及生长状况最好，48 h时发酵液中尼古丁含量已降至0.11 g/L，48 h时基本完全降解;而25 ℃时菌体生长缓慢，尼古丁降解效率低，仅在18～24 h时尼古丁有所降解，其他时段几乎检测不到明显的降解，发酵结束后培养基尼古丁浓度依然高达1.2 g/L。而在37 ℃时寡养单胞菌ZUC-3在尼古丁培养基中几乎不生长，几乎没有发生尼古丁的降解，表明ZUC-3代谢尼古丁对温度较为敏感。进一步实验发现37 ℃下ZUC-3在LB培养基中却可以正常生长，即37 ℃条件下只限制了ZUC-3对尼古丁的代谢能力，并未影响其正常生长能力。
2.3.3 pH对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 分别将ZUC-3接种于不同起始pH的尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min培养48 h后测定尼古丁浓度，计算降解率，结果如图6所示，不同pH对ZUC-3降解尼古丁的影响显著，其中在pH为6～7时，ZUC-3具有最好的尼古丁降解效果，pH为7时降解率最高，达到91%，而pH为4和10时，尼古丁降解率分别只有6.8%和20.3%，表明过酸或者过碱环境均不利于ZUC-3降解尼古丁。
2.3.4 接种量对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同接種量对ZUC-3降解尼古丁的影响如图7所示，3种接种量对尼古丁降解的影响差别不大，相比而言ZUC-3在10%的接种量下对尼古丁的降解效果最好。ZUC-3在3种接种量下，降解趋势几乎相同，均在12～24 h阶段降解速率达到最大，36 h达到降解终点，尼古丁降解充分。在本试验中，接种量对ZUC-3代谢尼古丁的影响不大，非主要参考因素，在后续试验中ZUC-3的接种量设置为10%。 2.3.5 发酵方式对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响如图8所示，由图可知，不同发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响明显，3种方式在前12 h内降解效果差别不大，12 h后开始出现较大差异，静置状态发酵时，尼古丁的降解率只有31.6%，而120 r/min和180 r/min时降解率分别为73.5%和92%，表明尼古丁的降解为耗氧过程，而转速的高低直接影响发酵液中的溶氧量，影响尼古丁的降解效果。
2.3.6 初始尼古丁浓度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 将寡养单胞菌ZUC-3分别接种到不同初始尼古丁浓度的尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养48 h后测定发酵液中的尼古丁浓度，计算降解率，考察ZUC-3对尼古丁的耐受程度。结果如图9所示，培养基初始尼古丁浓度在1～5 g/L时，尼古丁降解率均在80%以上，其中当初始尼古丁浓度为6 g/L时，尼古丁降解率降到49.01%，当尼古丁浓度高于7 g/L时，尼古丁降解率低至20%以下，表明ZUC-3降解尼古丁的活性范围为1～6 g/L，即ZUC-3菌株对尼古丁耐受性浓度为6 g/L。
2.4 寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的HPLC分析
对不同时间下尼古丁降解情况进行HPLC检测，结果如图10所示，0 h时尼古丁的保留时间在8.96 min左右，色谱峰清晰而完整，峰高为2 786.06 mAU。12 h时，尼古丁色谱峰降低，同时在5.24、5.47和10.31 min处产生新峰，表明尼古丁降解并产生中间产物。培养至24 h时，8.96 min处色谱峰消失，同时在2.60、2.79和3.71 min处产生新峰，即尼古丁进一步代谢所产生的降解产物。36 h时出峰位置同24 h时相同，但峰高及峰面积明显减少，表明中间产物也在继续代谢。48 h后，色谱峰值显著降低，峰值只有400 mAU，尼古丁降解产物种类和含量趋于稳定，降解过程到达终点。结果揭示ZUC-3高效的尼古丁降解能力，并且在代谢过程中产生了几种不同的中间代谢产物。
3 讨 论
本研究分离并鉴定得到一株具有高效尼古丁降解性能的菌株寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）ZUC-3，具体是否为该属新种还需进一步做全基因组测序及基因组ANI等相关分析，关于该菌种对尼古高降解活性的研究尚未见有报道[29-31]。生长-降解关系显示ZUC-3生长与尼古丁降解的同步性，即通过分解代谢尼古丁供给自身生长所需碳氮源及能源，这与TARARINA等[32]、ZHANG等[33]、
BRANDSCH[34]等报道的尼古丁降解微生物的生长-降解关系相一致。温度对尼古丁降解菌ZUC-3的影响显著，试验发现37 ℃条件下ZUC-3在尼古丁培养基中几乎不生长，但在LB普通培养基中却生长良好，先前IGLOI等[36]报道了尼古丁代谢质粒pAO1的功能相关基因序列及其介导的尼古丁代谢调控系统，因此推测ZUC-3的尼古丁降解相关基因可能编码于某类质粒上，当温度较高时（37 ℃）时则出现质粒丢失现象，导致ZUC-3虽然可以在LB培养基上生长，但由于丧失了分解利用尼古丁的能力，从而无法在尼古丁培养基上生长，后续将通过测序探究ZUC-3是否具有该类功能性质粒。
pH和发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响显著，ZUC-3的生长和尼古丁降解均在初始pH 7左右时为宜，这与普遍情况下寡养单胞菌的最适生長pH相一致[37];目前关于尼古丁降解微生物的相关报道均显示尼古丁的分解代谢为耗氧过程[18，22，38]，本试验通过设置不同发酵方式，结果表明ZUC-3的尼古丁代谢为耗氧过程，与先前文献报道相一致。耐受性试验表明ZUC-3具有较高的尼古丁耐受能力，在1～6 g/L尼古丁浓度范围内均具有较高的降解活性，与目前报道较多的尼古丁降解微生物Pseudomonas sp.（1～4 g/L），Arthrobacter sp.（0.5～2 g/L）等相比[39-40]，ZUC-3具备更高的尼古丁耐受性及降解效果。
通过HPLC动态检测ZUC-3的尼古丁降解过程，伴随尼古丁的逐步降解，观察到不同中间代谢产物的产生与消耗，显示出ZUC-3的高效尼古丁降解性能。与已报道[38，41-42]的研究结果相比，本试验结果显示ZUC-3降解尼古丁过程中可能产生了不同的中间代谢产物，推测ZUC-3可能遵从一种新的途径或是已知途径之间复杂的相互交联而形成的变形途径，具体机制需要对代谢产物做质谱鉴定，并结合基因组测序预测尼古丁降解相关基因及基因簇，阐述完整代谢通路。
通过探究尼古丁降解菌Stenotrophomonas ZUC-3的探究特性及降解过程，发现ZUC-3不仅对尼古丁具有高效的降解活性，而且具有较高的耐受性，尤其适合对目前烟草工业废弃物高浓度尼古丁污染物的降害处理，而且无需消耗其他辅助能源，既对环境友好，又节能降耗，有利于烟草工业的可持续发展。
4 结 论
分离鉴定得到一株具有高效尼古丁降解活性的寡养单胞菌Stenotrophomonas sp. ZUC-3。尼古丁降解特性表明，ZUC-3在1～6 g/L范围内均具有较高的尼古丁降解活性。单因素试验结果显示适宜条件为：温度30 ℃、起始pH 7.0、接种量10%及转速180 r/min，尼古丁降解率可达91.53%。HPLC结果表明尼古丁的降解过程伴随着不同中间产物的生成与消耗，揭示了ZUC-3的高效降解过程。本研究不仅为烟草工业废弃物的生物治理提供新的微生物资源，而且也为其他毒素的生物降解及其工业化应用提供新思路和线索。
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关键词：尼古丁;生物降解;Stenotrophomonas sp. ZUC-3;降解特性
中图分类号：TS41+1 文章编号：1007-5119（2019）01-0089-09 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.01.012
Abstract： The aim of this study was to isolate and identify a strain with high nicotine degradation activity in the situation where there are few kinds of nicotine-degrading microorganisms available， and to explore the conditions and characteristics of nicotine degradation， which will provide a new microbiological resource for the biodegradation of nicotine. A strain with high activity of nicotine degradation was obtained by isolation and purification from tobacco field soil. The strain was identified by morphological， physio-biochemical and 16S rRNA gene analysis， and the characteristics of nicotine degradation under different conditions were investigated with dynamic process by HPLC analysis. The optimum condition of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 was 30 ℃ with 10% inoculum at the initial pH 7.0 and 180 r/min， in which the rate of nicotine degradation by Stenotrophomonas sp. ZUC-3 reached 91.53%. HPLC analysis illustrated the dynamic process and high efficiency of nicotine degradation. The study provides a new microbiological resource for biodegradation of nicotine and has theoretical and practical significance in tobacco industry.
Keywords： nicotine; biodegradation; Stenotrophomonas sp. ZUC-3; degradation characteristics
尼古丁（Nicotine）具有高毒性，可透過生物膜，化学结构稳定不易降解[1]，并且是致癌物质烟草特有亚硝胺（TSNAs）的重要前体物[2]，由于其特殊的水溶性，能够与水以任意比例互溶，对人类生活及生态环境是一个极大的威胁[3]。我国作为世界上最大的烟草种植和加工生产的国家，在生产过程中产生大量含高浓度尼古丁的烟草加工废弃物[4]，所以环境中尼古丁的高效降解是目前一个亟待解决的问题。
微生物在自然环境下尼古丁的降解中扮演着极其重要的角色，YAO等[5]于烟草废弃物中分离出一株具有尼古丁降解能力的菌株，经鉴定为节杆菌属Arthrobacter sp. M2012083，通过对其基因组测序，预测了尼古丁代谢关键基因pAO1，但并未发现编码于质粒上的代谢功能基因。CHEN等[6]于烟草种植土壤中分离并鉴定出一株具有尼古丁降解性能的假单胞菌Pseudomonas sp. Nic22，并对其降解条件进行探究，结果表明，在30～34 ℃、pH 6.5条件下，48 h内可降解2 g/L的尼古丁。YUAN等[7]从烟草种植土壤中分离并鉴定出一株尼古丁降解菌中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium DN2，研究结果表明，该菌株降解尼古丁的最佳条件为30～37 ℃、pH 6.5，平均降解速率为140.5 mg/（L·h）。MENG等[8]于烟草叶片中分离并鉴定出一株具有尼古丁降解能力的曲霉属真菌Aspergillus oryzae 112822，结果表明，在28 ℃、pH 6.5条件下培养40 h后，该菌株的最高生长量为3.6 g/L，最高尼古丁降解量为2.19 g/L。生物降解相对于物理和化学降解过程，具有低成本、高效性、高选择性、环境友好等优势[9]，而且尼古丁降解微生物可将尼古丁转化为多种可再生的功能性中间代谢产物，例如生成的吡啶可作为前体物产生具有高医用价值的药物，也可作为高效安全的杀虫剂应用于生物防治领域[10-11]，过程简便可控，已成为当前研究的热点领域，具有良好的应用前景。 目前已报道的尼古丁降解微生物种类较为单一[12-14]，主要集中在节杆菌属[15-16]（Arthrobacter sp.）、根癌农杆菌[17-18]（Agrobacterium tumefaciens）、假单胞菌属[19-21]（Pseudomonas sp.）、苍白杆菌属[22]（Ochrobactrum sp.）、芽孢杆菌[21]（Bacillus thuringiensis）及某些真菌[22]。不同菌种对尼古丁降解的途径也不同，目前研究比较清楚的是以节杆菌为代表的吡啶途径[25]和以假单胞菌为代表的吡咯途径[26]。除此之外，某些烟草内生真菌具有特殊的尼古丁降解途径，但具体机制尚不清楚。
本研究从烟田土壤取样，分离出一株新的高活性尼古丁降解菌，并对其形态学、生理生化特性、16S rRNA基因序列进行分析鉴定，探究其降解特性，旨在为尼古丁生物降解领域微生物资源的开发与应用提供理论依据与技术指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
土壤样品：采自湖南省郴州市烟草种植基地。
1.2 培养基
Luria-Bertani（LB）培养基：NaCL 10.0 g/L，胰蛋白胨 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，溶解于蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。
尼古丁培养基：K2HPO4 13.30 g/L，KH2PO4 4.00 g/L，（NH4）2SO4 0.01 g/L，酵母粉1.00 g/L，尼古丁2.00 g/L;微量元素溶液10.00 mL（MgSO4·7H2O 1.00 g，MnSO4·H2O 0.40 g，CaCl2 0.15 g，CuCl2·2H2O 0.20 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，用0.10 mol/L HCL溶解至100 mL），溶解于蒸餾水中，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存备用。
尼古丁固体培养基：同尼古丁培养基，加入1.8%的琼脂即可。
1.3 仪器与设备
SW-CJ-1F型超净工作台：苏州净化设备有限公司;SYQ-DS2X-280B高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂;UV-2600紫外分光光度计：日本岛津公司;HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂;GHP-9160恒温培养箱：上海一恒科技有限公司;SI-0246漩涡混合仪：美国Scientific Industries公司;T100 PCR仪：美国Bio-Rad公司;Avanti J-25高速冷冻离心机：美国Beckman Coulter有限公司;JY3000C电泳仪：北京君意东方电泳设备有限公司;JCM-6000 Plus台式SEM扫描电镜：日本电子株式会社（JEOL）;Agilent1200高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司等。
1.4 方法
1.4.1 尼古丁降解菌的筛选与分离 取5 g土壤样品于95 mL带玻璃珠的无菌生理盐水中，30 ℃、180 r/min振荡20 min，静置5 min后取土壤菌悬液，用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布于尼古丁固体培养基，于30 ℃培养，定期观察，采用平板划线法多次分离纯化，挑取初筛的单菌落接种于尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养2～3 d，定时取样，测定发酵液尼古丁浓度及菌体生长量，选取降解情况最佳的菌株为目的菌株。
1.4.2 菌种鉴定 形态结构：将纯化后的目的菌种接种于固体尼古丁培养基上，30 ℃培养18～24 h后观察菌落形态，染色镜检观察菌体基本生理特征，扫描电子显微镜（SEM）观察菌体形态。
生理生化特征：生理生化指标的测定及方法参考《常见细菌系统鉴定手册》[28]。
16S rRNA基因序列同源性分析：（1）将目的菌株于30 ℃、180 r/min培养18 h作为种子液，然后按5%接种量转接于新鲜尼古丁培养基中培养24 h。使用Axygen细菌基因组DNA制备试剂盒，按照标准方法提取基因组DNA。（2）以提取的目的基因组DNA为模板，16S rRNA通用引物进行PCR扩增，反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR 扩增片段。（3）取纯化后的PCR产物进行DNA序列测定，将序列结果进行多序列比对并构建系统发育树。
1.4.3 菌株ZUC-3的降解特性试验 将种子液接入装液量为100 mL/250 mL的尼古丁培养基中，设置不同温度：25、30、37 ℃;不同pH：4、5、6、7、8、9、10;不同初始尼古丁浓度：1、2、3、4、5、6、7、8 g/L;不同接种量：5%、10%、15%;不同发酵方式：静置、120 r/min、180 r/min，定时取样，连续测定降解情况，探究温度、pH、接种量、初始尼古丁浓度、转速对ZUC-3降解尼古丁的影响。
1.4.4 ZUC-3降解尼古丁的HPLC检测 将种子液以10%的接种量接入尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，发酵液12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 ?m无菌滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：检测波长为259 nm，色谱柱为C18柱（4.6×250 mm，5 ?m），流动相为甲醇（色谱纯）：水（1 mmol/L H2SO4）=10∶90，柱温30 ℃，流速0.6 mL/min，进样量20 ?L。
1.5 测定指标及方法
尼古丁浓度测定：尼古丁在波长为259 nm处
存在吸收峰，采用紫外分光光度法测定尼古丁浓度。 将菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，发酵液离心（12 000 r/min，10 min，4 ℃）后，测定在259 nm处的吸光值。
菌体生长量测定：将菌株ZUC-3于30 ℃、180 r/min条件下培养，定时取样，采用紫外分光光度法测定菌体生长量，测定在600 nm处的吸光度，以OD600表示。
1.6 数据处理
每个处理均设置3个重复，采用SPSS 20.0和R 3.5.0进行数据统计和分析。
2 结 果
2.1 尼古丁降解菌ZUC-3的分离及对尼古丁降解作用
将ZUC-3以5%的接种量接入尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养48 h后，测定吸收光谱，结果如图1所示，对照组（CK）在259 nm存在吸收峰，接入ZUC-3菌株发酵48 h处理吸收峰消失，表明ZUC-3具有尼古丁降解能力。发酵液颜色在降解过程中也发生明显变化：初期没有发生颜色变化，当培养至12 h左右发酵液颜色开始变绿，随着时间增加颜色逐渐变深呈墨绿色，24 h左右墨绿色开始褪去，发酵液颜色变为深褐色，这与目前已报道的微生物降解尼古丁过程中的发酵液颜色变化有所不同，表明尼古丁降解过程中生成的中间产物可能不同。
2.2 ZUC-3菌种鉴定
2.2.1 形态学特征 ZUC-3在尼古丁固体培养基上，菌落形态初期较小，颜色通透，圆形，中间凸起，表面光滑，四周平滑无隆起，色泽湿润光亮（图2a）;当培养至一周左右，菌落变大，呈米黄色，不透明，圆形，表面光滑，中间突起，四周略微有隆起（图2b）;当培养至2～3周，菌落呈暗褐色（图2c），可能是ZUC-3在尼古丁降解过程中产生的有色代谢产物。SEM电镜结果显示菌体结构呈杆状，无鞭毛，大小为（2.1～2.3） ?m×（0.7～0.9） ?m（图2d）。
2.2.2 生理生化特征 ZUC-3为革兰氏阴性菌，无芽孢，好氧、运动，生长温度范围为4～39 ℃，pH生长范围为5～11。可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等碳源，发酵产酸缓慢或不产，能够还原硝酸盐，水解明胶，DNase、脂酶试验呈阳性，氧化酶、V-P、吲哚、甲基红、H2S、柠檬酸盐试验均呈阴性。
2.2.3 16S rRNA基因序列同源性分析 尼古丁降解菌ZUC-3的16S rRNA基因序列长度为1450 bp，将序列结果提交至GenBank，获得登录号MH 183291，用BLAST工具进行序列相似性比较，随机选取同源性较高的序列，进行多序列比对，构建系统发育树（图3），结果显示ZUC-3与Stenotrophomonas分枝较近。基于对尼古丁降解菌
ZUC-3的形态学、生理生化特征以及16S rRNA基因序列同源性分析，初步确定ZUC-3为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），命名为Stenotrophomonas sp. ZUC-3，该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018346。
2.3 Stenotrophomonas sp. ZUC-3的降解特性
2.3.1 寡养单胞菌ZUC-3生长与尼古丁降解的关系 将ZUC-3以5%接种量接种于新鲜尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养，定时取样，连续测定降解过程中尼古丁浓度的变化及ZUC-3的生长情况，结果如图4所示。菌株ZUC-3在0～12 h处于延滞期，生长较为缓慢，尼古丁降解缓慢;12～24 h，ZUC-3进入指数生长期，菌体生长速率最大，此时尼古丁降解速率也达到最大;30 h左右，ZUC-3生长量达到最大值，此时发酵液中尼古丁浓度降到0.45 g/L，降解率为78%;随后进入稳定期，尼古丁不断降解，48 h时发酵液中尼古丁已降至0.17 g/L，降解率达到91%，表明菌株ZUC-3对尼古丁具有高效降解的能力，菌体生长与尼古丁降解同步。
2.3.2 温度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同温度对ZUC-3降解尼古丁的影响如图5
所示，温度对ZUC-3降解尼古丁（图5a）及生长（图5b）的影响显著，30 ℃时ZUC-3降解尼古丁及生长状况最好，48 h时发酵液中尼古丁含量已降至0.11 g/L，48 h时基本完全降解;而25 ℃时菌体生长缓慢，尼古丁降解效率低，仅在18～24 h时尼古丁有所降解，其他时段几乎检测不到明显的降解，发酵结束后培养基尼古丁浓度依然高达1.2 g/L。而在37 ℃时寡养单胞菌ZUC-3在尼古丁培养基中几乎不生长，几乎没有发生尼古丁的降解，表明ZUC-3代谢尼古丁对温度较为敏感。进一步实验发现37 ℃下ZUC-3在LB培养基中却可以正常生长，即37 ℃条件下只限制了ZUC-3对尼古丁的代谢能力，并未影响其正常生长能力。
2.3.3 pH对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 分别将ZUC-3接种于不同起始pH的尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min培养48 h后测定尼古丁浓度，计算降解率，结果如图6所示，不同pH对ZUC-3降解尼古丁的影响显著，其中在pH为6～7时，ZUC-3具有最好的尼古丁降解效果，pH为7时降解率最高，达到91%，而pH为4和10时，尼古丁降解率分别只有6.8%和20.3%，表明过酸或者过碱环境均不利于ZUC-3降解尼古丁。
2.3.4 接种量对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同接種量对ZUC-3降解尼古丁的影响如图7所示，3种接种量对尼古丁降解的影响差别不大，相比而言ZUC-3在10%的接种量下对尼古丁的降解效果最好。ZUC-3在3种接种量下，降解趋势几乎相同，均在12～24 h阶段降解速率达到最大，36 h达到降解终点，尼古丁降解充分。在本试验中，接种量对ZUC-3代谢尼古丁的影响不大，非主要参考因素，在后续试验中ZUC-3的接种量设置为10%。 2.3.5 发酵方式对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 不同发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响如图8所示，由图可知，不同发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响明显，3种方式在前12 h内降解效果差别不大，12 h后开始出现较大差异，静置状态发酵时，尼古丁的降解率只有31.6%，而120 r/min和180 r/min时降解率分别为73.5%和92%，表明尼古丁的降解为耗氧过程，而转速的高低直接影响发酵液中的溶氧量，影响尼古丁的降解效果。
2.3.6 初始尼古丁浓度对寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的影响 将寡养单胞菌ZUC-3分别接种到不同初始尼古丁浓度的尼古丁培养基中，30 ℃、180 r/min摇床培养48 h后测定发酵液中的尼古丁浓度，计算降解率，考察ZUC-3对尼古丁的耐受程度。结果如图9所示，培养基初始尼古丁浓度在1～5 g/L时，尼古丁降解率均在80%以上，其中当初始尼古丁浓度为6 g/L时，尼古丁降解率降到49.01%，当尼古丁浓度高于7 g/L时，尼古丁降解率低至20%以下，表明ZUC-3降解尼古丁的活性范围为1～6 g/L，即ZUC-3菌株对尼古丁耐受性浓度为6 g/L。
2.4 寡养单胞菌ZUC-3降解尼古丁的HPLC分析
对不同时间下尼古丁降解情况进行HPLC检测，结果如图10所示，0 h时尼古丁的保留时间在8.96 min左右，色谱峰清晰而完整，峰高为2 786.06 mAU。12 h时，尼古丁色谱峰降低，同时在5.24、5.47和10.31 min处产生新峰，表明尼古丁降解并产生中间产物。培养至24 h时，8.96 min处色谱峰消失，同时在2.60、2.79和3.71 min处产生新峰，即尼古丁进一步代谢所产生的降解产物。36 h时出峰位置同24 h时相同，但峰高及峰面积明显减少，表明中间产物也在继续代谢。48 h后，色谱峰值显著降低，峰值只有400 mAU，尼古丁降解产物种类和含量趋于稳定，降解过程到达终点。结果揭示ZUC-3高效的尼古丁降解能力，并且在代谢过程中产生了几种不同的中间代谢产物。
3 讨 论
本研究分离并鉴定得到一株具有高效尼古丁降解性能的菌株寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）ZUC-3，具体是否为该属新种还需进一步做全基因组测序及基因组ANI等相关分析，关于该菌种对尼古高降解活性的研究尚未见有报道[29-31]。生长-降解关系显示ZUC-3生长与尼古丁降解的同步性，即通过分解代谢尼古丁供给自身生长所需碳氮源及能源，这与TARARINA等[32]、ZHANG等[33]、
BRANDSCH[34]等报道的尼古丁降解微生物的生长-降解关系相一致。温度对尼古丁降解菌ZUC-3的影响显著，试验发现37 ℃条件下ZUC-3在尼古丁培养基中几乎不生长，但在LB普通培养基中却生长良好，先前IGLOI等[36]报道了尼古丁代谢质粒pAO1的功能相关基因序列及其介导的尼古丁代谢调控系统，因此推测ZUC-3的尼古丁降解相关基因可能编码于某类质粒上，当温度较高时（37 ℃）时则出现质粒丢失现象，导致ZUC-3虽然可以在LB培养基上生长，但由于丧失了分解利用尼古丁的能力，从而无法在尼古丁培养基上生长，后续将通过测序探究ZUC-3是否具有该类功能性质粒。
pH和发酵方式对ZUC-3降解尼古丁的影响显著，ZUC-3的生长和尼古丁降解均在初始pH 7左右时为宜，这与普遍情况下寡养单胞菌的最适生長pH相一致[37];目前关于尼古丁降解微生物的相关报道均显示尼古丁的分解代谢为耗氧过程[18，22，38]，本试验通过设置不同发酵方式，结果表明ZUC-3的尼古丁代谢为耗氧过程，与先前文献报道相一致。耐受性试验表明ZUC-3具有较高的尼古丁耐受能力，在1～6 g/L尼古丁浓度范围内均具有较高的降解活性，与目前报道较多的尼古丁降解微生物Pseudomonas sp.（1～4 g/L），Arthrobacter sp.（0.5～2 g/L）等相比[39-40]，ZUC-3具备更高的尼古丁耐受性及降解效果。
通过HPLC动态检测ZUC-3的尼古丁降解过程，伴随尼古丁的逐步降解，观察到不同中间代谢产物的产生与消耗，显示出ZUC-3的高效尼古丁降解性能。与已报道[38，41-42]的研究结果相比，本试验结果显示ZUC-3降解尼古丁过程中可能产生了不同的中间代谢产物，推测ZUC-3可能遵从一种新的途径或是已知途径之间复杂的相互交联而形成的变形途径，具体机制需要对代谢产物做质谱鉴定，并结合基因组测序预测尼古丁降解相关基因及基因簇，阐述完整代谢通路。
通过探究尼古丁降解菌Stenotrophomonas ZUC-3的探究特性及降解过程，发现ZUC-3不仅对尼古丁具有高效的降解活性，而且具有较高的耐受性，尤其适合对目前烟草工业废弃物高浓度尼古丁污染物的降害处理，而且无需消耗其他辅助能源，既对环境友好，又节能降耗，有利于烟草工业的可持续发展。
4 结 论
分离鉴定得到一株具有高效尼古丁降解活性的寡养单胞菌Stenotrophomonas sp. ZUC-3。尼古丁降解特性表明，ZUC-3在1～6 g/L范围内均具有较高的尼古丁降解活性。单因素试验结果显示适宜条件为：温度30 ℃、起始pH 7.0、接种量10%及转速180 r/min，尼古丁降解率可达91.53%。HPLC结果表明尼古丁的降解过程伴随着不同中间产物的生成与消耗，揭示了ZUC-3的高效降解过程。本研究不仅为烟草工业废弃物的生物治理提供新的微生物资源，而且也为其他毒素的生物降解及其工业化应用提供新思路和线索。
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