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摘要 通过初选、复选和精选，从海南岛35个油茶居群中选出5株油茶优树，它们具有抗炭疽病强、产果量高、含油率高等特点，鲜果出籽率45.57%～52.00%，鲜果出油率7.30%～10.93%，单位冠幅产油0.11～0.21 kg/m2，产油量770.55～1 470.05 kg/hm2，茶油的酸值在0.21～0.30 mg/g之间，不饱和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亚油酸含量5.06%～6.32%。基于SRAP标记，以引物组合Me1/Em4可把5个优树区分开，构建了直观、清晰、简单的DNA指纹图谱。
关键词 油茶；优树；DNA指纹图谱
中图分类号 S565.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0005-03
Selection and DNA Fingerprinting Construct of Camellia oleifera in Hainan
CHEN Wei-wen 1 ZHENG Dao-jun 2 YANG Li-rong 2 YUN Yong 2 CHEN Jia-li 2 CHEN Xuan 2 *
（1 Forest Seed and Seeding General Station of Hainan Province，Haikou Hainan 570203； 2 Institute of Tropical Horticulture，
Hainan Academy of Agricultural Sciences）
Abstract 5 plus trees from 35 populations were checked ultimately in Hainan，the results showed that these plus trees with the characters of anti-anthrax，high fruit and oil production.The plus trees′ fresh seed rate was 45.57%～52.00%，oil production rate was 7.30%～10.93%，oil production was 0.11～0.21 kg/m2 in crown units，oil production was 770.55～1 470.05 kg/hm2，and the oil acid value was 0.21～0.30 mg/g，the unsaturated fatty acids was 85.78%～89.10%，the linoleic acid content was 5.06%～6.32%.Based on SRAP markers，the primer composition Me1/Em4 could distinguish the 5 plus trees，construct clear and simple DNA fingerprintings.
Key words Camellia oleifera；plus trees；DNA fingerprinting
油茶（Camellia oleifera Abel.）與橄榄、油棕、椰子并称世界四大木本油料植物，其茶油有丰富的营养成分和优越的保健功能，有“食油之王”“东方橄榄油”等美誉，已被国际粮农组织列为重点推广的健康型食用油[1]。海南省具有发展油茶产业的优质特色资源和气候环境优势，油茶产业又是极富有开发前景的特色生态产业[2]，充分挖掘海南省油茶资源，选育新品种，可加快海南省农林业产业结构调整，促进农民增收，对促进海南省国际旅游岛建设具有非常重要的意义。但是，由于海南油茶资源开发较晚，目前还没有经过审定的品种，单株产量低、良种少已成为当前海南油茶发展的关键瓶颈问题之一[3-5]。
目前，从现有林分中选择优良单株，是油茶新品种（无性系）培育的必经步骤。从20世纪60年代起，我国油茶育种工作者相继在全国各地选择了林相较好的6 700 hm2油茶林进行选优，初选优树11 000多株。经过复选和精选，最后决选出1 000多株优树。其中，广西、江西、湖南、浙江等省（区）较多[6]，如安徽农业大学从1999年8月开始对安徽舒城县境内的油茶品种资源状况做了一次较为全面的调查，并在现有资源中初选出2个优良单株[7]。安徽省农业科学院针对安徽省祁门县境内原有的实生油茶林资源进行考察研究，并筛选出一批优株[8]。重庆市林业科学研究院等单位调查了重庆市36个油茶林分布，实测235株油茶单株，初步选出63株优树[9]。目前生产上广泛应用的无性系或品种，如湘林系列、亚林系列、赣系列、丰系列、长林系列、岑软系列和桂无系列，均是在优株基础上培育而成。
为了较好地鉴定油茶新品种或无性系，国内学者应用分子标记技术研究构建了部分油茶新品种或无性系。如林萍等[10]采用SRAP标记技术，对油茶长林系列进行分析，建立了全部供试材料的DNA指纹图谱，实现了12个无性系的有效鉴别；李阿池[11]通过建立和优化AFLP体系，构建了从福建省17个县市50份参试材料的DNA指纹图谱；张国武等[12]、温 强等[13]采用ISSR分子标记方法，建立了25个油茶无性系的DNA指纹库。可见，应用分子标记技术对油茶新品种（系）进行研究可获得可靠的结果。据此，本研究拟筛选出海南油茶优树并构建DNA指纹图谱，为海南油茶资源开发利用提供可靠的科学依据。
1 研究内容与方法
1.1 调查范围和时间
在查阅植物标本和相关文献资料基础上，采用踏查法结合走访当地农户、农林业部门、油茶加工点，尤其是油茶果实或茶油收购商，对海南岛油茶资源分布情况进行了全面的实地调查。同时，对各分布区15年以上油茶林林分现状进行了调查。项目组走访调查了海南省海口、定安、文昌、琼海、澄迈、屯昌、琼中、五指山和临高9个市（县）的38个乡镇（国营农场），重点调查了分布区内的35个油茶林（表1），这些乡镇基本涵盖了海南省主要油茶分布区。调查时间从2013年9月至2015年11月，包括了3个油茶花果期。 1.2 优选方法
通过实地调查，初步观测油茶的树形、果实分布、果实大小和花芽分布等情况，以及植株的病虫害情况，并剖视果皮厚薄程度。初步估计树冠挂果平均1.0 kg/m2以上，春梢枝数不少于挂果枝数，80%以上的春梢有花芽，而且花芽健壮、分布均匀者，即为初选优株。在此基础上，分株采集充分成熟的果实测定相关的性状指标，并在树干上挂牌标记优树编号。
1.3 优树选择标准
油茶优树选择标准参照中华人民共和国林业行业标准《油茶第1部分：优树选择和优良无性系选育技术规程》（LY/T 1730.1—2008）进行。海南油茶母株优树选择的条件如下：
（1）树形完整，树冠开张，生长良好。
（2）无病或病害较轻，果实炭疽病率在3%以下。
（3）果实大小分布均匀，按冠幅乘积计算，2年平均单株鲜果产量为1 m2冠幅产茶果1.0 kg以上，小年产量不低于大年的50%；鲜果含油率7%以上；茶油酸价0.3以下。
（4）决选时，在上述条件相近的情况下，优先选择亚油酸含量高的单株（亚油酸的含量是选择和判断油茶品种品质优劣的重要评价指标之一）。
1.4 茶油理化性质
种仁含油率测定采用索氏抽取法，具体步骤参照中华人民共和国国家标准《植物油料含油量测定》（GB/T 14488.1—2008）。油茶籽脂肪酸甲酯的制备按照GB/T 17376—2008标准进行，按照GB/T 17377—2008标准进行气相色谱分析。茶油酸值测定按《食用植物油卫生标准分析方法》（GB/T 5009.37—2003）中酸值的测定方法进行。
1.5 优树DNA指纹图谱构建
采用改良CTAB法提取油茶总DNA，PCR-SRAP扩增实验体系参考林 萍等[10]方法，然后取10 μL PCR扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，EB染色后，在Gel Doc XR型凝胶成像系统中观察、分析、记录，每个反应重复1次。
根据PCR扩增产物的电泳结果，采用人工读带的方法，在凝胶的某个相同迁移率位置上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，获得每个引物的Excel 0-1矩阵。扩增片段大小参照DNA ladder估测，扩增片段编号由引物编号加片段大小组成。分别统计分析各优树的特异标记、唯一缺失带以及单一引物（组合）的特征谱带。筛选出最佳引物（组合）后，根据0-1矩阵在Excel中绘制胶板图的标准化图，从而构建油茶优株的DNA指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 海南油茶优树初选结果
2013年10—12月之间，通过实地调查35个油茶居群（表1），实测243株油茶树，结果表明，海南油茶种仁出油率较高，平均值为51.98%，海南不同油茶居群茶油的出油率变化不大，变异系数仅为4.21%；酸值、碘值和过氧化值在不同油茶居群间的变化则较大，平均酸值0.45 mg/g，变异系数达到38.6%；平均碘值102.99 g/100 g，变异系数为20.62%；平均过氧化值为3.39 mmol/kg，变异系数为27.92%。从中初选优树30株，这些初选优树的鲜果出籽率均达到38%以上，树体生长良好，无病虫害。
在2014年10—12月、2015年10—12月分别对上述初选优树进行复选和精选，最终确定5株优树。5株优树的形态与经济性状表现分别见表2和表3。
2013—2015连续3年的观测结果表明，所选优树的花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果实成熟期10月中上旬至11月上旬，具有抗炭疽病强、产果量高、含油率高等特点。单鲜果重26.66～76.69 g，鲜果出籽率45.57%～52.00%，鲜果出油率7.30%～10.93%，单位冠幅产油0.11～0.21 kg/m2，产油量770.55～1 470.05 kg/hm2，连续3年观测平均值见表4。茶油酸值在0.21～0.30 mg/g之间，不饱和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亚油酸含量在5.06%～6.32%之间（表5），相关特性指标表现优异。
2.2 优树指纹图谱
基于SRAP标记，以引物组合Me1/Em4可把5个优树区分开，构建了直观、清晰、简单的DNA指纹图谱。其中琼优1在1 200 bp处有特异带，琼优2在1 800 bp和850 bp处有特异带，琼优3在500 bp和180 bp处有特异带，琼优4在950 bp处有唯一缺失带，琼优6在1 500 bp和350 bp处有特异带，均可作为唯一特异性鉴别条带。
3 结论
3.1 筛选获得优树5株
本研究最终确定5株優树，特征为花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果实成熟期10月中上旬至11月上旬，平均单鲜果重42.33 g，平均鲜果出籽率为48.04%，鲜果平均出油率为8.59%，单位冠幅平均产油量为0.14 kg/m2，最高可达0.21 kg/m2，平均产油量为952.48 kg/hm2，最高可达1 470.05 kg/hm2，茶油平均酸值在0.24 mg/g，不饱和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亚油酸含量在5.06%～6.32%之间，平均为5.69%，相关特性指标综合表现优异。
3.2 构建优树的DNA指纹图谱
基于SRAP标记，以引物组合Me1/Em4可把5个优树区分开，构建了直观、清晰、简单的DNA指纹图谱。
4 参考文献
[1] 黄敦元，郝家胜，余江帆，等.油茶研究现状与展望[J].生命科学研究，2009，13（5）：459-465.
[2] 郑道君，潘孝忠，谢良商，等.海南省油茶产业发展现状调查与分析[J].经济林研究，2015，33（1）：131-135.
[3] 郑道君，潘孝忠，张冬明，等.海南油茶资源调查与分析[J].西北林学院学报，2016（1）：130-135.
[4] 袁军，韩志强，贺舍予，等.海南省油茶资源主要形态和经济性状及聚类分析[J].植物遗传资源学报，2014（6）：1380-1384.
[5] 王碧芳，邹锋，袁德义，等.海南油茶优良单株果实经济性状综合评价与筛选[J].福建农林大学学报（自然科学版），2016（2）：156-161.
[6] 庄瑞林.我国油茶良种选育工作的历史回顾与展望[J].林业科技开发，2010，24（6）：1-4.
[7] 陈素传，肖正东，汪小进，等.安徽大别山区油茶优株选择初报[J].安徽林业科技，2011（2）：8-12.
[8] 王文杰，陈长庚，黄建琴，等.高产优质油茶单株的选择研究[J].中国农学通报，2010（20）：136-140.
[9] 陈勇，赵渝丽，杨小平，等.重庆市油茶优树调查与初选评价[J].西南师范大学学报（自然科学版），2010（5）：156-161.
[10] 林萍，姚小华，王开良，等.油茶长林系列优良无性系的SRAP分子鉴别及遗传分析[J].农业生物技术学报，2010，18（2）：272-279.
[11] 李阿池.福建省油茶主栽品种的DNA指纹鉴定[D].福州：福建农林大学，2010.
[12] 张国武，钟文斌，乌云塔娜，等.油茶优良无性系ISSR分子鉴别[J].林业科学研究，2007，20（2）：278-282.
[13] 温强，雷小林，叶金山，等.油茶高产无性系的ISSR分子鉴别[J].中南林业科技大学学报，2008，28（1）：39.
关键词 油茶；优树；DNA指纹图谱
中图分类号 S565.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）07-0005-03
Selection and DNA Fingerprinting Construct of Camellia oleifera in Hainan
CHEN Wei-wen 1 ZHENG Dao-jun 2 YANG Li-rong 2 YUN Yong 2 CHEN Jia-li 2 CHEN Xuan 2 *
（1 Forest Seed and Seeding General Station of Hainan Province，Haikou Hainan 570203； 2 Institute of Tropical Horticulture，
Hainan Academy of Agricultural Sciences）
Abstract 5 plus trees from 35 populations were checked ultimately in Hainan，the results showed that these plus trees with the characters of anti-anthrax，high fruit and oil production.The plus trees′ fresh seed rate was 45.57%～52.00%，oil production rate was 7.30%～10.93%，oil production was 0.11～0.21 kg/m2 in crown units，oil production was 770.55～1 470.05 kg/hm2，and the oil acid value was 0.21～0.30 mg/g，the unsaturated fatty acids was 85.78%～89.10%，the linoleic acid content was 5.06%～6.32%.Based on SRAP markers，the primer composition Me1/Em4 could distinguish the 5 plus trees，construct clear and simple DNA fingerprintings.
Key words Camellia oleifera；plus trees；DNA fingerprinting
油茶（Camellia oleifera Abel.）與橄榄、油棕、椰子并称世界四大木本油料植物，其茶油有丰富的营养成分和优越的保健功能，有“食油之王”“东方橄榄油”等美誉，已被国际粮农组织列为重点推广的健康型食用油[1]。海南省具有发展油茶产业的优质特色资源和气候环境优势，油茶产业又是极富有开发前景的特色生态产业[2]，充分挖掘海南省油茶资源，选育新品种，可加快海南省农林业产业结构调整，促进农民增收，对促进海南省国际旅游岛建设具有非常重要的意义。但是，由于海南油茶资源开发较晚，目前还没有经过审定的品种，单株产量低、良种少已成为当前海南油茶发展的关键瓶颈问题之一[3-5]。
目前，从现有林分中选择优良单株，是油茶新品种（无性系）培育的必经步骤。从20世纪60年代起，我国油茶育种工作者相继在全国各地选择了林相较好的6 700 hm2油茶林进行选优，初选优树11 000多株。经过复选和精选，最后决选出1 000多株优树。其中，广西、江西、湖南、浙江等省（区）较多[6]，如安徽农业大学从1999年8月开始对安徽舒城县境内的油茶品种资源状况做了一次较为全面的调查，并在现有资源中初选出2个优良单株[7]。安徽省农业科学院针对安徽省祁门县境内原有的实生油茶林资源进行考察研究，并筛选出一批优株[8]。重庆市林业科学研究院等单位调查了重庆市36个油茶林分布，实测235株油茶单株，初步选出63株优树[9]。目前生产上广泛应用的无性系或品种，如湘林系列、亚林系列、赣系列、丰系列、长林系列、岑软系列和桂无系列，均是在优株基础上培育而成。
为了较好地鉴定油茶新品种或无性系，国内学者应用分子标记技术研究构建了部分油茶新品种或无性系。如林萍等[10]采用SRAP标记技术，对油茶长林系列进行分析，建立了全部供试材料的DNA指纹图谱，实现了12个无性系的有效鉴别；李阿池[11]通过建立和优化AFLP体系，构建了从福建省17个县市50份参试材料的DNA指纹图谱；张国武等[12]、温 强等[13]采用ISSR分子标记方法，建立了25个油茶无性系的DNA指纹库。可见，应用分子标记技术对油茶新品种（系）进行研究可获得可靠的结果。据此，本研究拟筛选出海南油茶优树并构建DNA指纹图谱，为海南油茶资源开发利用提供可靠的科学依据。
1 研究内容与方法
1.1 调查范围和时间
在查阅植物标本和相关文献资料基础上，采用踏查法结合走访当地农户、农林业部门、油茶加工点，尤其是油茶果实或茶油收购商，对海南岛油茶资源分布情况进行了全面的实地调查。同时，对各分布区15年以上油茶林林分现状进行了调查。项目组走访调查了海南省海口、定安、文昌、琼海、澄迈、屯昌、琼中、五指山和临高9个市（县）的38个乡镇（国营农场），重点调查了分布区内的35个油茶林（表1），这些乡镇基本涵盖了海南省主要油茶分布区。调查时间从2013年9月至2015年11月，包括了3个油茶花果期。 1.2 优选方法
通过实地调查，初步观测油茶的树形、果实分布、果实大小和花芽分布等情况，以及植株的病虫害情况，并剖视果皮厚薄程度。初步估计树冠挂果平均1.0 kg/m2以上，春梢枝数不少于挂果枝数，80%以上的春梢有花芽，而且花芽健壮、分布均匀者，即为初选优株。在此基础上，分株采集充分成熟的果实测定相关的性状指标，并在树干上挂牌标记优树编号。
1.3 优树选择标准
油茶优树选择标准参照中华人民共和国林业行业标准《油茶第1部分：优树选择和优良无性系选育技术规程》（LY/T 1730.1—2008）进行。海南油茶母株优树选择的条件如下：
（1）树形完整，树冠开张，生长良好。
（2）无病或病害较轻，果实炭疽病率在3%以下。
（3）果实大小分布均匀，按冠幅乘积计算，2年平均单株鲜果产量为1 m2冠幅产茶果1.0 kg以上，小年产量不低于大年的50%；鲜果含油率7%以上；茶油酸价0.3以下。
（4）决选时，在上述条件相近的情况下，优先选择亚油酸含量高的单株（亚油酸的含量是选择和判断油茶品种品质优劣的重要评价指标之一）。
1.4 茶油理化性质
种仁含油率测定采用索氏抽取法，具体步骤参照中华人民共和国国家标准《植物油料含油量测定》（GB/T 14488.1—2008）。油茶籽脂肪酸甲酯的制备按照GB/T 17376—2008标准进行，按照GB/T 17377—2008标准进行气相色谱分析。茶油酸值测定按《食用植物油卫生标准分析方法》（GB/T 5009.37—2003）中酸值的测定方法进行。
1.5 优树DNA指纹图谱构建
采用改良CTAB法提取油茶总DNA，PCR-SRAP扩增实验体系参考林 萍等[10]方法，然后取10 μL PCR扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，EB染色后，在Gel Doc XR型凝胶成像系统中观察、分析、记录，每个反应重复1次。
根据PCR扩增产物的电泳结果，采用人工读带的方法，在凝胶的某个相同迁移率位置上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，获得每个引物的Excel 0-1矩阵。扩增片段大小参照DNA ladder估测，扩增片段编号由引物编号加片段大小组成。分别统计分析各优树的特异标记、唯一缺失带以及单一引物（组合）的特征谱带。筛选出最佳引物（组合）后，根据0-1矩阵在Excel中绘制胶板图的标准化图，从而构建油茶优株的DNA指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 海南油茶优树初选结果
2013年10—12月之间，通过实地调查35个油茶居群（表1），实测243株油茶树，结果表明，海南油茶种仁出油率较高，平均值为51.98%，海南不同油茶居群茶油的出油率变化不大，变异系数仅为4.21%；酸值、碘值和过氧化值在不同油茶居群间的变化则较大，平均酸值0.45 mg/g，变异系数达到38.6%；平均碘值102.99 g/100 g，变异系数为20.62%；平均过氧化值为3.39 mmol/kg，变异系数为27.92%。从中初选优树30株，这些初选优树的鲜果出籽率均达到38%以上，树体生长良好，无病虫害。
在2014年10—12月、2015年10—12月分别对上述初选优树进行复选和精选，最终确定5株优树。5株优树的形态与经济性状表现分别见表2和表3。
2013—2015连续3年的观测结果表明，所选优树的花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果实成熟期10月中上旬至11月上旬，具有抗炭疽病强、产果量高、含油率高等特点。单鲜果重26.66～76.69 g，鲜果出籽率45.57%～52.00%，鲜果出油率7.30%～10.93%，单位冠幅产油0.11～0.21 kg/m2，产油量770.55～1 470.05 kg/hm2，连续3年观测平均值见表4。茶油酸值在0.21～0.30 mg/g之间，不饱和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亚油酸含量在5.06%～6.32%之间（表5），相关特性指标表现优异。
2.2 优树指纹图谱
基于SRAP标记，以引物组合Me1/Em4可把5个优树区分开，构建了直观、清晰、简单的DNA指纹图谱。其中琼优1在1 200 bp处有特异带，琼优2在1 800 bp和850 bp处有特异带，琼优3在500 bp和180 bp处有特异带，琼优4在950 bp处有唯一缺失带，琼优6在1 500 bp和350 bp处有特异带，均可作为唯一特异性鉴别条带。
3 结论
3.1 筛选获得优树5株
本研究最终确定5株優树，特征为花白色，通常初花期在10月下旬至11月下旬，果实成熟期10月中上旬至11月上旬，平均单鲜果重42.33 g，平均鲜果出籽率为48.04%，鲜果平均出油率为8.59%，单位冠幅平均产油量为0.14 kg/m2，最高可达0.21 kg/m2，平均产油量为952.48 kg/hm2，最高可达1 470.05 kg/hm2，茶油平均酸值在0.24 mg/g，不饱和脂肪酸含量85.78%～89.10%，亚油酸含量在5.06%～6.32%之间，平均为5.69%，相关特性指标综合表现优异。
3.2 构建优树的DNA指纹图谱
基于SRAP标记，以引物组合Me1/Em4可把5个优树区分开，构建了直观、清晰、简单的DNA指纹图谱。
4 参考文献
[1] 黄敦元，郝家胜，余江帆，等.油茶研究现状与展望[J].生命科学研究，2009，13（5）：459-465.
[2] 郑道君，潘孝忠，谢良商，等.海南省油茶产业发展现状调查与分析[J].经济林研究，2015，33（1）：131-135.
[3] 郑道君，潘孝忠，张冬明，等.海南油茶资源调查与分析[J].西北林学院学报，2016（1）：130-135.
[4] 袁军，韩志强，贺舍予，等.海南省油茶资源主要形态和经济性状及聚类分析[J].植物遗传资源学报，2014（6）：1380-1384.
[5] 王碧芳，邹锋，袁德义，等.海南油茶优良单株果实经济性状综合评价与筛选[J].福建农林大学学报（自然科学版），2016（2）：156-161.
[6] 庄瑞林.我国油茶良种选育工作的历史回顾与展望[J].林业科技开发，2010，24（6）：1-4.
[7] 陈素传，肖正东，汪小进，等.安徽大别山区油茶优株选择初报[J].安徽林业科技，2011（2）：8-12.
[8] 王文杰，陈长庚，黄建琴，等.高产优质油茶单株的选择研究[J].中国农学通报，2010（20）：136-140.
[9] 陈勇，赵渝丽，杨小平，等.重庆市油茶优树调查与初选评价[J].西南师范大学学报（自然科学版），2010（5）：156-161.
[10] 林萍，姚小华，王开良，等.油茶长林系列优良无性系的SRAP分子鉴别及遗传分析[J].农业生物技术学报，2010，18（2）：272-279.
[11] 李阿池.福建省油茶主栽品种的DNA指纹鉴定[D].福州：福建农林大学，2010.
[12] 张国武，钟文斌，乌云塔娜，等.油茶优良无性系ISSR分子鉴别[J].林业科学研究，2007，20（2）：278-282.
[13] 温强，雷小林，叶金山，等.油茶高产无性系的ISSR分子鉴别[J].中南林业科技大学学报，2008，28（1）：39.