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摘要：目的：研究力竭游泳运动对小鼠前脑皮层和海马神经元功能的影响及其作用机制。方法：采用力竭游泳运动小鼠模型，检测反复（4周）力竭游泳运动后即刻（0小时）、12小时、24小时和1周小鼠前脑皮层、海马突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度的变化，通过Morris水迷宫测试小鼠空间学习记忆能力。结果：反复力竭游泳运动后，与正常对照组小鼠比较，力竭运动组在12 h和24 h小鼠的逃避潜伏期（训练周期1）明显增加，第一象限停留时间明显减少，其空间学习记忆能力显著降低（P<0.01，P<0.05）；力竭运动组小鼠前脑皮层和海马突触体膜流动性在0 h、12 h显著降低（P<0.01，P<0.05） ；前脑皮层和海马突触体内游离Ca2+浓度在0 h、12 h和24 h显著增加 （P<0.05，P<0.01），力竭运动后1周前脑皮层和海马突触体内游离Ca2+浓度明显恢复（P<0.05）。结论：力竭游泳运动所致小鼠空间学习记忆功能损伤以及运动性中枢疲劳的产生和恢复可能与突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度的变化密切相关。
关键词：力竭运动；膜流动性；Ca2+浓度；空间学习记忆；海马；前脑皮层
中图分类号：G 804.2文献标识码：A文章编号：1009-9840（2014）05-0080-03
力竭性运动表现为动物或人进行运动直到完全不能运动为止[1]。由于运动负荷过大，超过机体的承受能力，可引起机体多器官功能紊乱，尤其是导致中枢神经系统运动性疲劳，造成脑功能损伤。前脑皮层和海马是脑内运动的调控、学习记忆、神经内分泌及认知功能的重要区域，也是最易受运动应激损伤的脑区[2]。突触体膜的结构和功能变化可引起突触处信息传递效能发生改变，尤其是突触体膜流动性的改变将影响膜的离子通透性、跨膜物质转运、胞内信号转导等。在脑内神经元受损及脑的老化过程中，膜流动性也显示相应的改变[3]。本研究建立4周反复力竭游泳运动小鼠模型，测定力竭游泳运动和恢复期小鼠Morris 水迷宫空间学习记忆能力，检测小鼠前脑皮层和海马突触体膜流动性、突触体内游离Ca2+浓度的变化，探讨力竭游泳运动对小鼠空间学习记忆功能影响，以及运动性中枢疲劳产生与恢复的突触机制。
1材料与方法
1.1实验动物和分组
3月龄健康昆明品系小白鼠，雌雄各半，山东鲁抗医药股份有限公司动物实验中心提供。适应性喂养一周后随机分为：正常对照组，反复性力竭游泳运动组。
1.2力竭游泳运动小鼠模型的建立
建立4周反复力竭游泳运动小鼠模型。实验用小鼠接受连续3d的适应性游泳训练，自由游泳每天一次，持续时间分别为15 min、30 min、45 min逐日递增。水温30±2 ℃。4周反复力竭游泳运动小鼠，每天游泳训练一次，每次游泳训练均至力竭，每周5天；为避免力竭训练组大鼠在训练过程中产生适应现象，在训练的后期采用负重（体重的2%）的方法增加游泳训练的强度，每次训练均要求达到力竭状态。力竭游泳运动标准为：1）游泳动作明显失调，不能再坚持；2）沉入水底超过3 s不能回到水面。停止游泳运动训练，及时捞起，吹干毛发，放回饲养笼中休息。力竭游泳运动后即刻（0小时）、12小时、24小时和1周，检测小鼠前脑皮层和海马突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度。
1.3Morris水迷宫学习记忆能力检测
力竭游泳运动后12小时、24小时和1周，对小鼠实施Morris水迷宫实验。Morris 水迷宫包含定位航行实验（Place navigation test）和空间搜索实验（Spatial probe test）。定位航行实验历时2 d，每只小鼠每天接受8次找平台训练，分2个训练周期（上午和下午），每个训练周期4次，每次训练2 min。记录小鼠寻找到隐藏在水下平台时间即逃避潜伏期，检测小鼠在水迷宫中的学习能力；第3 d撤除平台进行空间搜索实验，从第三象限将小鼠放入水中，记录120 s内小鼠在4个象限游泳（停留）时间，检测小鼠对原平台（目标象限）记忆保持能力。
[JP3]1.4突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度的测定[JP]
将各组小鼠断头处死，在冰台上迅速分离两侧前脑皮层和海马并称重，加入10倍体积的0.32 M蔗糖溶液（内含10 mM Hepes，pH 7.4，W：V = 1：10）进行匀浆。按差速蔗糖梯度离心法分离制备突触体，最后用人工脑脊液（ACSF）缓慢悬浮，得到突触体悬液，所有操作均在0～4 ℃进行。分别取前脑皮层和海马突触体悬液，用ACSF调整蛋白浓度为0.3 mg/ml，与等体积的荧光探针DPH（Fluka公司产品，终浓度2×10-6 M）稀释液，置于37 ℃恒温孵育30 min。用荧光偏振法检测突触体膜的荧光偏振度（P），测定温度37 ℃。用膜各向异性（anisotropy）r值表示突触体膜的流动性大小，r值越小，膜流动性越大。取前脑皮层和海马突触体悬液，用ACSF调整蛋白浓度为1.5～2.5 mg/ml，加入Fura 2-AM（Sigma公司产品，终浓度：5 μ M）， 37 ℃恒温孵育30 min后，于11 000 ×g离心10 min，取沉淀，用ACSF悬浮，于0～4 ℃下保存直至荧光测定。采用双波长测定，选择Fura-2与Ca2+结合和游离的激发波长340 nm和380 nm，发射波长为509 nm。在37 ℃条件下，测定其荧光强度及荧光比值。计算突触体内钙离子浓度。
1.5统计学分析
所有数据以均数±标准差（± s）表示，采用SPSS 13.0进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），对各象限游泳时间及力竭运动后各时间点数据进行多重比较，逃避潜伏期采用重复测量方差分析，行LSD-t检验或非配对t检验。P<0.05表示具有统计学显著性差异。
关键词：力竭运动；膜流动性；Ca2+浓度；空间学习记忆；海马；前脑皮层
中图分类号：G 804.2文献标识码：A文章编号：1009-9840（2014）05-0080-03
力竭性运动表现为动物或人进行运动直到完全不能运动为止[1]。由于运动负荷过大，超过机体的承受能力，可引起机体多器官功能紊乱，尤其是导致中枢神经系统运动性疲劳，造成脑功能损伤。前脑皮层和海马是脑内运动的调控、学习记忆、神经内分泌及认知功能的重要区域，也是最易受运动应激损伤的脑区[2]。突触体膜的结构和功能变化可引起突触处信息传递效能发生改变，尤其是突触体膜流动性的改变将影响膜的离子通透性、跨膜物质转运、胞内信号转导等。在脑内神经元受损及脑的老化过程中，膜流动性也显示相应的改变[3]。本研究建立4周反复力竭游泳运动小鼠模型，测定力竭游泳运动和恢复期小鼠Morris 水迷宫空间学习记忆能力，检测小鼠前脑皮层和海马突触体膜流动性、突触体内游离Ca2+浓度的变化，探讨力竭游泳运动对小鼠空间学习记忆功能影响，以及运动性中枢疲劳产生与恢复的突触机制。
1材料与方法
1.1实验动物和分组
3月龄健康昆明品系小白鼠，雌雄各半，山东鲁抗医药股份有限公司动物实验中心提供。适应性喂养一周后随机分为：正常对照组，反复性力竭游泳运动组。
1.2力竭游泳运动小鼠模型的建立
建立4周反复力竭游泳运动小鼠模型。实验用小鼠接受连续3d的适应性游泳训练，自由游泳每天一次，持续时间分别为15 min、30 min、45 min逐日递增。水温30±2 ℃。4周反复力竭游泳运动小鼠，每天游泳训练一次，每次游泳训练均至力竭，每周5天；为避免力竭训练组大鼠在训练过程中产生适应现象，在训练的后期采用负重（体重的2%）的方法增加游泳训练的强度，每次训练均要求达到力竭状态。力竭游泳运动标准为：1）游泳动作明显失调，不能再坚持；2）沉入水底超过3 s不能回到水面。停止游泳运动训练，及时捞起，吹干毛发，放回饲养笼中休息。力竭游泳运动后即刻（0小时）、12小时、24小时和1周，检测小鼠前脑皮层和海马突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度。
1.3Morris水迷宫学习记忆能力检测
力竭游泳运动后12小时、24小时和1周，对小鼠实施Morris水迷宫实验。Morris 水迷宫包含定位航行实验（Place navigation test）和空间搜索实验（Spatial probe test）。定位航行实验历时2 d，每只小鼠每天接受8次找平台训练，分2个训练周期（上午和下午），每个训练周期4次，每次训练2 min。记录小鼠寻找到隐藏在水下平台时间即逃避潜伏期，检测小鼠在水迷宫中的学习能力；第3 d撤除平台进行空间搜索实验，从第三象限将小鼠放入水中，记录120 s内小鼠在4个象限游泳（停留）时间，检测小鼠对原平台（目标象限）记忆保持能力。
[JP3]1.4突触体膜流动性和突触体内游离Ca2+浓度的测定[JP]
将各组小鼠断头处死，在冰台上迅速分离两侧前脑皮层和海马并称重，加入10倍体积的0.32 M蔗糖溶液（内含10 mM Hepes，pH 7.4，W：V = 1：10）进行匀浆。按差速蔗糖梯度离心法分离制备突触体，最后用人工脑脊液（ACSF）缓慢悬浮，得到突触体悬液，所有操作均在0～4 ℃进行。分别取前脑皮层和海马突触体悬液，用ACSF调整蛋白浓度为0.3 mg/ml，与等体积的荧光探针DPH（Fluka公司产品，终浓度2×10-6 M）稀释液，置于37 ℃恒温孵育30 min。用荧光偏振法检测突触体膜的荧光偏振度（P），测定温度37 ℃。用膜各向异性（anisotropy）r值表示突触体膜的流动性大小，r值越小，膜流动性越大。取前脑皮层和海马突触体悬液，用ACSF调整蛋白浓度为1.5～2.5 mg/ml，加入Fura 2-AM（Sigma公司产品，终浓度：5 μ M）， 37 ℃恒温孵育30 min后，于11 000 ×g离心10 min，取沉淀，用ACSF悬浮，于0～4 ℃下保存直至荧光测定。采用双波长测定，选择Fura-2与Ca2+结合和游离的激发波长340 nm和380 nm，发射波长为509 nm。在37 ℃条件下，测定其荧光强度及荧光比值。计算突触体内钙离子浓度。
1.5统计学分析
所有数据以均数±标准差（± s）表示，采用SPSS 13.0进行统计学分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），对各象限游泳时间及力竭运动后各时间点数据进行多重比较，逃避潜伏期采用重复测量方差分析，行LSD-t检验或非配对t检验。P<0.05表示具有统计学显著性差异。