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杨东元 罗锦辉 高建华 朱金华
(第一军医大学南方医院整形外科 广州510515)
［摘 要］ 目的：探讨分类定量检测病理性瘢痕成纤维细胞内前胶原的方法。 方法：以病理性瘢痕成纤维细胞作研究对象，用粘附式细胞仪(以下简称ACAS-570)分类量化比较细胞内前胶原蛋白。 结果：ACAS-570直观地显示及量化了细胞内前胶原蛋白，不同类型病理性瘢痕成纤维细胞内前胶原蛋白存在着明显不同。 结论：ACAS-570免疫细胞化学分类定量检测胶原蛋白的方法，在瘢痕基础研究中有一定的应用价值。
［关键词］ 病理性瘢痕 成纤维细胞 免疫细胞化学
［中图分类号］R619+.6 ［文献标识码］A ［文章编号］1008-6455(2000)06-0407-03
THE RESEARCH ON SEPARATE QUANTITATION OF PROCOLLGEN IN PATHOLOG ICAL
SCAR-DERIVED FIBROBLASTS
YANG Dong-yuan LUO Jin-hui GAO Jian-hua et al.
Department of Plastic Surgery,Nanfang hospital,The First Military Medical University,(Guangzhou 510515)
[Abstract]ObjectiveTo investigate separate quantitation of procollagen in pathological scar-derived fibroblasts. Methods:The study directly quantitated the type Ⅲ procollagen of fibroblasts by ACAS-570. Results:Different quantitation of type Ⅲ procollagen in different kinds of fibroblast s were clearly showed. Conclusion:The separate quantitation of procollagen by means of ACAS-570 immunocytochemistry is very useful in the basic study on mechanism of pathological scar.
[Key words] Pathological scar Fibroblast Immunocyto chemistry
创伤愈合过程中成纤维细胞合成过多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原且不成比例，使胶原过量沉积而形成增殖性瘢痕及瘢痕疙瘩等病理性瘢痕，导致畸形〔1〕，这一直是美容整形外科的主要治疗难题。因此分类定量检测成纤维细胞内前胶原蛋白并动态观察两者比值的变化，成为研究病理性瘢痕形成机理并进而防治它的关键之一〔2〕。但目前检测成纤维细胞内前胶原蛋白的方法多采用同位素示踪术中的3 H-脯氨酸掺入法〔3〕，它有以下四点不足：①定量了细胞内全部前胶原蛋白，而无法分别定量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白；②容易造成实验室内的放射性污染；③不能立即完成统计学分析；④直观性较差。随着瘢痕研究水平的步步深入，相应地要求胶原检测手段的改进与提高。九十年代以后，先进的由计算机控制的粘附式激光细胞扫描仪及图像分析系统的出现，使细胞生物学及免疫细胞化学的研究向前大大迈进，也使我们应用间接免疫荧光法建立分类检测定量病理性瘢痕成纤维细胞内各型前胶原蛋白的检测方法成为可能。本文以体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞为实验对象，建立了分类检测定量病理性瘢痕成纤维细胞内前原蛋白的检测方法并用此方法比较了增殖性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞在合成Ⅲ型前胶原蛋白上的不同。
1 原理
先用特异性的抗Ⅲ型胶原抗体(第一抗体)与细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记抗体(第二抗体)与一抗结合，形成抗原-抗体-荧光素标记抗体复合物，荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光，特异性荧光含量即灵敏地反映了细胞内Ⅲ型前胶原的含量。
2 材料和方法
2.1 主要试剂与仪器 主要试剂 DMEM 培养基干粉(美国GIBCO 公司)、胰蛋白酶(美国SIGMA 公司)、HEPES(香港FARCO 公司)、鼠抗人Ⅲ型胶原抗体(美国GIBCO 公司)、超级亲生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、羊抗鼠IgG荧光抗体(北京军事医学科学院微生物流行病研究所) 主要仪器 ACAS-570粘附式激光扫描细胞仪(美国Meridian 公司)
2.2 本实验所用瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本均取自第一军医大学南方医院整形外科病人，瘢痕疙瘩成纤维细胞为实验组，增殖性瘢痕成纤维细胞为对照组。
2.3 方法
2.3.1 原代培养 按常规进行。
2.3.2 传代培养 按常规进行，实验用第4～25代细胞。
2.3.3 ACAS-570分析细胞内胶原含量 ①样品制备 调整细胞悬液浓度为1.0×104/ml，接种数滴于特殊进口培养皿中央孔中，待细胞贴壁后，加入完全培养基，孵箱培养24h；PBS清洗，70%冰乙醇固定，置4℃、冷育30min；PBS清洗，各加入50μl 10%FBS封闭非特异性抗原，室温20min；加入1∶400鼠抗人Ⅲ型胶原的第一抗体10μl；置4℃湿盒，冷育24h；PBS清洗，加入1∶8FITC标记的羊抗鼠的第二抗体40μl，置4℃湿盒，冷育12h。 ②测定 将标记好的细胞标本依次置于ACAS-570粘附式激光扫描细胞仪上，以紫外线波长488nm测定细胞内被标记的Ⅲ型前胶原的荧光强度。每个扫描视野大约有40～80个细胞，共测细胞约400～800个，自动统计分析平均荧光值。每次实验扫描参数相同：PMT1(测量器1灵敏度)40%、Step size(扫描强度)10%、Speed(速度)8、Laser power(激光功率)10mW、Samples /dt(每次采样次数)32、Autozoom(自动增益)8、Arearange(荧光范围)100～1000。
3 结果
本实验成功地用荧光清晰标记并显示出了成纤维细胞内的Ⅲ型前胶原蛋白(图1，图2)并将每一组的平均荧光值自动统计，绘出直方图(图3，图4)，ACAS-570自行两两比， 显示实验组与对照组间有显著性差异(P＜0.001)(图5)；说明瘢痕疙瘩成纤维细胞内前胶原蛋白的合成量高于增殖性瘢痕成纤维细胞内前胶原蛋白的合成量，从而量 化地反映了不同类型的病理性瘢痕其合成胶原的能力存在着差异。
图1 实验组(瘢痕疙瘩)成纤维细胞内
Ⅲ型前胶原蛋白荧光扫描图
图2 对照组(增殖性瘢痕)成纤维细胞内
Ⅲ型前胶原蛋白荧光扫描图
图3 实验组细胞平均胶原蛋白荧光值直方图，呈正态分布
图4 对照组细胞平均胶原蛋白荧光值直方图，呈正态分布
图5 实验组与对照组比较，两组平均荧光值分离，相差显著
4 讨论
瘢痕组织的病理学特征是以胶原为主的细胞外基质的大量沉积〔4〕，而成纤维细胞是胶原的主要来源，它合成并分泌了Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白分子。几十年来国内外整形外科界一直沿用放射性同位素示踪术中的3 H-脯氨酸掺入法来检测细胞内胶原〔5〕，脯氨酸是合成Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白的必需氨基酸，因此上述方法测到的只是细胞内总的前胶原蛋白量，而且它易造成实验室的放射性污染。随着瘢痕研究的深入，迫切要求能分别准确定量Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白。Coons 和Coworkers于1941年通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质获得成功，建立了免疫荧光技术。人们在此基础上进一步完善，并将免疫荧光技术与形态结构相结合发展成为免疫荧光组织细胞化学技术，尤其是1958年合成了异硫氰基荧光素(FITC)，它与抗体较易形成稳定的结合物，因而使免疫荧光技术得到迅速推广〔6〕。如今，它已和现代激光技术、电子计算机和扫描电视技术相结合发展为定量免疫荧光组织化学技术，ACAS-570(Adherent Cell Analysis and Sorting)的出现使免疫荧光组织化学技术的定位更准确，开创了免疫荧光组织细胞化学技术的新领域。本实验将免疫荧光细胞化学与粘附式细胞仪结合应用，建立起分类检测成纤维细胞内前胶原蛋白的新方法，与3 H-脯氨酸掺入法相比，它具有灵敏、准确、直观、自动统计分析等优点。如果一抗运用抗Ⅰ型胶原抗体的话，按本文步骤，同样可以建立起检测Ⅰ型前胶原蛋白的方法，目前国内外还鲜有报道。
近年来，随着计算机图像分析系统的出现，使免疫细胞化学及细胞化学从定性水平深入到了定量水平。因此，我们还可以应用免疫细胞化学方法，如ABC法及SP法等，用颜色标记出成纤维细胞内各型前胶原蛋白，而DAB显色深浅是同抗原量成正比的〔7〕，将切片进一步做图像分析，也能达到定量前胶原蛋白的目的。图像分析法直观、简单，与同位素示踪术相比，也有一定的实用价值。
粘附式激光扫描细胞仪免疫荧光细胞化学分类定量检测胶原法也有其一定的缺点：如荧光素标记抗体不稳定，标本染色后必须立即检测，不能长久保存等。
［参考文献］
1 D.W.Thomas.The pathogenesis of hypertrophic/keloid scarring［J］.Int J Oral Maxillofac Surg,1994;23:232～235
2 Otto J.Placik.Immunologic Associations of Keloids［J］.Surgery,Gynecology and Obstetrics,1992;175:185～189
3 Matthew R.Duncan.Differential Regulation of Collagen Production in Culturde Human Adult Dermal Fibroblast by IL-l［J］.J Invest Dermatol,1989;92:699～703
4 Khan S.The pathology of deloid scars［J］.Surgery,1988;54:1299～1301
5 Clre JN.Quantittive assay of type Ⅰ and Ⅲ collagen synthesis by keloid biopsies and fibroblasts［J］.Biochem Biophys Acta,1979;586:384～387
6 杨景山主编.医用细胞化学与细胞生物技术［M］.北京：北京医科大学出版社，1990： 268
7 倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术及应用［M］.北京：北京科学技术出版社，1993：65
作者简介：杨东元 男，1967年生。1991年毕业于第四军医大学军医系。1996年毕业于第一军医大学，获外科学医学硕士学位，现工作于南方医院整形外科，参加两项国家自然科学基金项目和一项国家卫生部电教教材制作项目，发表于国家一类杂志论文7篇。
收稿日期 2000－08－18
编辑／樊延南
(第一军医大学南方医院整形外科 广州510515)
［摘 要］ 目的：探讨分类定量检测病理性瘢痕成纤维细胞内前胶原的方法。 方法：以病理性瘢痕成纤维细胞作研究对象，用粘附式细胞仪(以下简称ACAS-570)分类量化比较细胞内前胶原蛋白。 结果：ACAS-570直观地显示及量化了细胞内前胶原蛋白，不同类型病理性瘢痕成纤维细胞内前胶原蛋白存在着明显不同。 结论：ACAS-570免疫细胞化学分类定量检测胶原蛋白的方法，在瘢痕基础研究中有一定的应用价值。
［关键词］ 病理性瘢痕 成纤维细胞 免疫细胞化学
［中图分类号］R619+.6 ［文献标识码］A ［文章编号］1008-6455(2000)06-0407-03
THE RESEARCH ON SEPARATE QUANTITATION OF PROCOLLGEN IN PATHOLOG ICAL
SCAR-DERIVED FIBROBLASTS
YANG Dong-yuan LUO Jin-hui GAO Jian-hua et al.
Department of Plastic Surgery,Nanfang hospital,The First Military Medical University,(Guangzhou 510515)
[Abstract]ObjectiveTo investigate separate quantitation of procollagen in pathological scar-derived fibroblasts. Methods:The study directly quantitated the type Ⅲ procollagen of fibroblasts by ACAS-570. Results:Different quantitation of type Ⅲ procollagen in different kinds of fibroblast s were clearly showed. Conclusion:The separate quantitation of procollagen by means of ACAS-570 immunocytochemistry is very useful in the basic study on mechanism of pathological scar.
[Key words] Pathological scar Fibroblast Immunocyto chemistry
创伤愈合过程中成纤维细胞合成过多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原且不成比例，使胶原过量沉积而形成增殖性瘢痕及瘢痕疙瘩等病理性瘢痕，导致畸形〔1〕，这一直是美容整形外科的主要治疗难题。因此分类定量检测成纤维细胞内前胶原蛋白并动态观察两者比值的变化，成为研究病理性瘢痕形成机理并进而防治它的关键之一〔2〕。但目前检测成纤维细胞内前胶原蛋白的方法多采用同位素示踪术中的3 H-脯氨酸掺入法〔3〕，它有以下四点不足：①定量了细胞内全部前胶原蛋白，而无法分别定量Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白；②容易造成实验室内的放射性污染；③不能立即完成统计学分析；④直观性较差。随着瘢痕研究水平的步步深入，相应地要求胶原检测手段的改进与提高。九十年代以后，先进的由计算机控制的粘附式激光细胞扫描仪及图像分析系统的出现，使细胞生物学及免疫细胞化学的研究向前大大迈进，也使我们应用间接免疫荧光法建立分类检测定量病理性瘢痕成纤维细胞内各型前胶原蛋白的检测方法成为可能。本文以体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞为实验对象，建立了分类检测定量病理性瘢痕成纤维细胞内前原蛋白的检测方法并用此方法比较了增殖性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞在合成Ⅲ型前胶原蛋白上的不同。
1 原理
先用特异性的抗Ⅲ型胶原抗体(第一抗体)与细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记抗体(第二抗体)与一抗结合，形成抗原-抗体-荧光素标记抗体复合物，荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光，特异性荧光含量即灵敏地反映了细胞内Ⅲ型前胶原的含量。
2 材料和方法
2.1 主要试剂与仪器 主要试剂 DMEM 培养基干粉(美国GIBCO 公司)、胰蛋白酶(美国SIGMA 公司)、HEPES(香港FARCO 公司)、鼠抗人Ⅲ型胶原抗体(美国GIBCO 公司)、超级亲生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、羊抗鼠IgG荧光抗体(北京军事医学科学院微生物流行病研究所) 主要仪器 ACAS-570粘附式激光扫描细胞仪(美国Meridian 公司)
2.2 本实验所用瘢痕疙瘩和增殖性瘢痕标本均取自第一军医大学南方医院整形外科病人，瘢痕疙瘩成纤维细胞为实验组，增殖性瘢痕成纤维细胞为对照组。
2.3 方法
2.3.1 原代培养 按常规进行。
2.3.2 传代培养 按常规进行，实验用第4～25代细胞。
2.3.3 ACAS-570分析细胞内胶原含量 ①样品制备 调整细胞悬液浓度为1.0×104/ml，接种数滴于特殊进口培养皿中央孔中，待细胞贴壁后，加入完全培养基，孵箱培养24h；PBS清洗，70%冰乙醇固定，置4℃、冷育30min；PBS清洗，各加入50μl 10%FBS封闭非特异性抗原，室温20min；加入1∶400鼠抗人Ⅲ型胶原的第一抗体10μl；置4℃湿盒，冷育24h；PBS清洗，加入1∶8FITC标记的羊抗鼠的第二抗体40μl，置4℃湿盒，冷育12h。 ②测定 将标记好的细胞标本依次置于ACAS-570粘附式激光扫描细胞仪上，以紫外线波长488nm测定细胞内被标记的Ⅲ型前胶原的荧光强度。每个扫描视野大约有40～80个细胞，共测细胞约400～800个，自动统计分析平均荧光值。每次实验扫描参数相同：PMT1(测量器1灵敏度)40%、Step size(扫描强度)10%、Speed(速度)8、Laser power(激光功率)10mW、Samples /dt(每次采样次数)32、Autozoom(自动增益)8、Arearange(荧光范围)100～1000。
3 结果
本实验成功地用荧光清晰标记并显示出了成纤维细胞内的Ⅲ型前胶原蛋白(图1，图2)并将每一组的平均荧光值自动统计，绘出直方图(图3，图4)，ACAS-570自行两两比， 显示实验组与对照组间有显著性差异(P＜0.001)(图5)；说明瘢痕疙瘩成纤维细胞内前胶原蛋白的合成量高于增殖性瘢痕成纤维细胞内前胶原蛋白的合成量，从而量 化地反映了不同类型的病理性瘢痕其合成胶原的能力存在着差异。
图1 实验组(瘢痕疙瘩)成纤维细胞内
Ⅲ型前胶原蛋白荧光扫描图
图2 对照组(增殖性瘢痕)成纤维细胞内
Ⅲ型前胶原蛋白荧光扫描图
图3 实验组细胞平均胶原蛋白荧光值直方图，呈正态分布
图4 对照组细胞平均胶原蛋白荧光值直方图，呈正态分布
图5 实验组与对照组比较，两组平均荧光值分离，相差显著
4 讨论
瘢痕组织的病理学特征是以胶原为主的细胞外基质的大量沉积〔4〕，而成纤维细胞是胶原的主要来源，它合成并分泌了Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白分子。几十年来国内外整形外科界一直沿用放射性同位素示踪术中的3 H-脯氨酸掺入法来检测细胞内胶原〔5〕，脯氨酸是合成Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白的必需氨基酸，因此上述方法测到的只是细胞内总的前胶原蛋白量，而且它易造成实验室的放射性污染。随着瘢痕研究的深入，迫切要求能分别准确定量Ⅰ型及Ⅲ型前胶原蛋白。Coons 和Coworkers于1941年通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质获得成功，建立了免疫荧光技术。人们在此基础上进一步完善，并将免疫荧光技术与形态结构相结合发展成为免疫荧光组织细胞化学技术，尤其是1958年合成了异硫氰基荧光素(FITC)，它与抗体较易形成稳定的结合物，因而使免疫荧光技术得到迅速推广〔6〕。如今，它已和现代激光技术、电子计算机和扫描电视技术相结合发展为定量免疫荧光组织化学技术，ACAS-570(Adherent Cell Analysis and Sorting)的出现使免疫荧光组织化学技术的定位更准确，开创了免疫荧光组织细胞化学技术的新领域。本实验将免疫荧光细胞化学与粘附式细胞仪结合应用，建立起分类检测成纤维细胞内前胶原蛋白的新方法，与3 H-脯氨酸掺入法相比，它具有灵敏、准确、直观、自动统计分析等优点。如果一抗运用抗Ⅰ型胶原抗体的话，按本文步骤，同样可以建立起检测Ⅰ型前胶原蛋白的方法，目前国内外还鲜有报道。
近年来，随着计算机图像分析系统的出现，使免疫细胞化学及细胞化学从定性水平深入到了定量水平。因此，我们还可以应用免疫细胞化学方法，如ABC法及SP法等，用颜色标记出成纤维细胞内各型前胶原蛋白，而DAB显色深浅是同抗原量成正比的〔7〕，将切片进一步做图像分析，也能达到定量前胶原蛋白的目的。图像分析法直观、简单，与同位素示踪术相比，也有一定的实用价值。
粘附式激光扫描细胞仪免疫荧光细胞化学分类定量检测胶原法也有其一定的缺点：如荧光素标记抗体不稳定，标本染色后必须立即检测，不能长久保存等。
［参考文献］
1 D.W.Thomas.The pathogenesis of hypertrophic/keloid scarring［J］.Int J Oral Maxillofac Surg,1994;23:232～235
2 Otto J.Placik.Immunologic Associations of Keloids［J］.Surgery,Gynecology and Obstetrics,1992;175:185～189
3 Matthew R.Duncan.Differential Regulation of Collagen Production in Culturde Human Adult Dermal Fibroblast by IL-l［J］.J Invest Dermatol,1989;92:699～703
4 Khan S.The pathology of deloid scars［J］.Surgery,1988;54:1299～1301
5 Clre JN.Quantittive assay of type Ⅰ and Ⅲ collagen synthesis by keloid biopsies and fibroblasts［J］.Biochem Biophys Acta,1979;586:384～387
6 杨景山主编.医用细胞化学与细胞生物技术［M］.北京：北京医科大学出版社，1990： 268
7 倪灿荣主编.免疫组织化学实验新技术及应用［M］.北京：北京科学技术出版社，1993：65
作者简介：杨东元 男，1967年生。1991年毕业于第四军医大学军医系。1996年毕业于第一军医大学，获外科学医学硕士学位，现工作于南方医院整形外科，参加两项国家自然科学基金项目和一项国家卫生部电教教材制作项目，发表于国家一类杂志论文7篇。
收稿日期 2000－08－18
编辑／樊延南