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摘要：建立了用超高效液相色谱法（UPLC）同时测定中药材丹参中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和二氢丹参酮的超高效液相色谱法。中药材样品中的丹参酮用高速匀浆法提取，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7um，Φ2.1mm×50mm，超高效液相色谱柱为固定相，40%的乙腈（内含0.1%的磷酸）为流动相分离，检测波长为254nm，流速为0.6mL/min。在上述色谱条件下隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和二氢丹参酮在5.0min内实现基线分离，加标回收率在91.5%～98.6%之间，日内相对标准偏差为2.1%，日间相对标准偏差为2.8%，结果满意。
关键词：丹参酮；丹参；超高效液相色谱法
中图分类号: R917 文献标识码：B 文章编号：1004-7484(2012)06-0123-03
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根，是一种常用的临床中药。脂溶性丹参酮类化合物是丹参的主要有效成分，具有增加血流量和扩张冠状动脉的作用。对心肌梗塞、心肌损害、心绞痛和冠心病具有一定疗效，因此丹参药材中丹参酮含量的测定对药材质量评价具有一定意义［1］，目前报道的丹参酮类化合物的含量测定方法主要有毛细管气相色谱法[2]、薄层扫描色谱法[3]和高效液相色变法等[4-7]，其中最常用的是高效液相色谱法，常规高效液相色谱法分离时间长、流动相消耗大。超高效液相色谱分析比常规高效液相色谱分析速度更快、灵敏度更高，它使用1.7um颗粒度的色谱柱填料，能够获得更高的柱效，还能节省分析时间和增加峰容量[8-13]。文献[10]报道了超高效液相色谱测定药材中的丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量，样品处理方法采用超声提取法，但超声提取法噪音污染大，而且色谱分离也需要15min。本文研究了用匀浆法提取，超高效液相色谱法测定中药材丹参中的隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的方法，样品前处理速度显著加快，而且4种丹参酮在5min内可达到完全分离，大大缩短了分离时间。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
ACQUITY超高效液相色谱仪（配二级管阵列检测器），美国Waters公司，Empower色谱工作站。
隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品检定所。
丹参药材均购自昆明各药材市场。
乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2 色谱条件
色谱柱为Water ACQUITY UPLC BEH C18（1.7um，φ2.1mm×50mm）超高效液相色谱柱；流动相为40%的乙腈（内含0.1%的磷酸）；检测波长为254um；流速为0.6mL/min；柱温30℃；样进量5.0uL。在该条件下丹参样品的标样的色谱图见图1.
图1 标样（a）和丹参样品（b）的色谱图
1.3 样品处理
丹参样品粉碎，过0.172mm目筛，准确称取样品0.1g，置于50mL锥型瓶中，准确加入20mL的乙腈，置于高速匀浆机2000r/min匀浆萃取2.0min，取1.0mL的提取液，用0.45um针头过滤器过滤，进样2.0uL分析。
2 结果与讨论
2.1 流动相的选择
二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA属于菲醌类化合物，化合物极性中等，因此实验首先选择乙腈-水混合溶剂为流动相，采用反相温文尔雅相色谱法进行分离测定，色谱峰有明显拖尾现象，流动相中加入少量磷酸可抑制峰拖尾现象，所以实验考虑在流动相中加入少量H3PO4用来抑制峰的拖尾。当流动相中乙腈的比例为40%时样品中4种丹参酮类化合物可达到完全分离，因此，本实验选用40%的乙腈（内含0.1%的磷酸）为流动相。
2.2 检测波长的选择
二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的乙腈溶液的紫外可见吸收光谱表明，此4种化合物的吸收光谱和最大吸收波长存在明显差异，但在254nm处均有较大吸收，因此本实验选择了254um作为4组分的检测波长。
2.3 样品前处理
丹参酮类物质在乙腈中具有较大的溶解度，本实验中采用乙腈为提取溶剂。匀浆提取法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，已广泛应用于样品前处理[8-9]，因此实验选用匀浆法提取。实验结果表明，0.2g的样品用20mL的乙腈提取，高速勻浆机2000转/min提取只需2.0min可让样品中丹参酮类化合物完全溶出（收集残渣再提取1次已经没有丹参酮检出）；因此本实验选用高速匀浆法2000r/min提取2.0min。由于没有干扰峰，提取液可直接进样分析。
2.4 回归方程、相关系数及检测限
配制质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50ug/mL的丹参酮标准溶液，在选定测定条件下进样5.0uL，根据测得的峰面积A对应的质量浓度C进行线性回归，得到回归方程，再将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5.0uL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，结果见表1.
表1 回归方程、相关系数及检测限
2.5 精密度实验
样品按1.3所述样品前处理方法处理，然后按选定色谱条件进样分析，在相同条件下每样平行测定7次，相对标准偏差为2.1%，另取样品每天测定1次，连续测定7d，计算日间相对标准偏差为2.8%，说明方法日内精密度和日间精密度均满意。
2.6 回收率实验
称取相同样品2份，其中一份为对照，另一份加入已知量的丹参酮标样（3个加入量），通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表2。从表2可看出，样品的加标回收率均在91.5%-98.6%之间，方法回收率高。
2.7 样品分析结果
用该方法测定了不同丹参样品中的隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，样品按前述样品前处理的方法处理后按选定色谱条件进样分析，结果见表3。 3 结论
本方法采用匀浆法提取，超高效液相色谱法测定中药材丹参中的丹参酮，高速匀速法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于回流提取、振荡浸取法和超声波浸取法。此外，本方法还采用超高效液相色谱技术，5min完成1个样品分析，和常规液相色谱法相比分离时间大大缩短，提高了工作效率。总之，本方法具有准确、快速、高灵敏度和高选择性的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求。
参考文献：
[1] 徐艳萍.浅谈中药丹参中丹参酮的药理作用及临床应用研究进展[J].中国药物应用与监测,2002,11(3):36-38.
[2] 魏晓舒,胡英娟.毛细管气相色谱法测定复方丹参片中冰片含量[J].药物分析杂志,2005,25(12):1565-1566.
[3] 张静,颜耀东.薄层扫描法测定健脑益智胶囊中丹参酮ⅡA含量[J].解放军药学学报,2004，20(5):392-393.
[4] 邵林,郭庆梅,李明娟,等.不同产地丹参指标性成分和浸出物的含量测定[J].中华中医药学刊,2010,23(1):85-87.
[5] 唐小峦,李焕德.HPLC-UV/ESI-MS法分析丹参不同提取组分[J].中南药学,2008,6(6):707-711.
[6] 原文鹏,刘林娜,马双成.HPLC法测定山丹酮缓释片中丹参酮类成分的含量[J].中国药房,2008,19(9):681-682.
[7] 何丽仙,黄忠京,谭倪,等.HPLC芍药草混合煎与分煎的化学成分变化[J].云南师范大学学报：自然科学版,2009,29(6):32-35.
[8] 赵善仓,赵领军,谷小红,等.超高效液相色谱串联质谱法测定小麦籽粒中麦黄酮[J].分析化学,2009,37(6):873-876.
[9] 马强,白桦,王超,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玩具中的16种致癌和致敏染料[J].分析化学,2010,38(1):51-56.
[10]甘宾宾,蔡卓,蒋世琼,等.超高效液相色谱在现代分析检验中的应用进展[J].中国卫生检验杂志,2008,18(5):955-957.
[11]刘梅,俞桂新,张勉,等.超高效液相色谱法同时测定丹参药材中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量[J].中国中药杂志,2008.33(3)319-321.
[12]徐祎然,李海燕,李银科,等.匀浆法提取-离子色谱法測定烟草中的糖[J].云南民族大学学报：自然科学版,2010,19(1):43-45.
[13]崔柱文,汤丹俞,李海燕,等.匀浆法提取-离子色谱法测定烟草中阴离子的研究[J].云南民族大学学报:自然科学版,2009,18(4):325-327.
关键词：丹参酮；丹参；超高效液相色谱法
中图分类号: R917 文献标识码：B 文章编号：1004-7484(2012)06-0123-03
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参的干燥根，是一种常用的临床中药。脂溶性丹参酮类化合物是丹参的主要有效成分，具有增加血流量和扩张冠状动脉的作用。对心肌梗塞、心肌损害、心绞痛和冠心病具有一定疗效，因此丹参药材中丹参酮含量的测定对药材质量评价具有一定意义［1］，目前报道的丹参酮类化合物的含量测定方法主要有毛细管气相色谱法[2]、薄层扫描色谱法[3]和高效液相色变法等[4-7]，其中最常用的是高效液相色谱法，常规高效液相色谱法分离时间长、流动相消耗大。超高效液相色谱分析比常规高效液相色谱分析速度更快、灵敏度更高，它使用1.7um颗粒度的色谱柱填料，能够获得更高的柱效，还能节省分析时间和增加峰容量[8-13]。文献[10]报道了超高效液相色谱测定药材中的丹酚酸B和丹参酮ⅡA含量，样品处理方法采用超声提取法，但超声提取法噪音污染大，而且色谱分离也需要15min。本文研究了用匀浆法提取，超高效液相色谱法测定中药材丹参中的隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的方法，样品前处理速度显著加快，而且4种丹参酮在5min内可达到完全分离，大大缩短了分离时间。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
ACQUITY超高效液相色谱仪（配二级管阵列检测器），美国Waters公司，Empower色谱工作站。
隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品购自中国药品生物制品检定所。
丹参药材均购自昆明各药材市场。
乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2 色谱条件
色谱柱为Water ACQUITY UPLC BEH C18（1.7um，φ2.1mm×50mm）超高效液相色谱柱；流动相为40%的乙腈（内含0.1%的磷酸）；检测波长为254um；流速为0.6mL/min；柱温30℃；样进量5.0uL。在该条件下丹参样品的标样的色谱图见图1.
图1 标样（a）和丹参样品（b）的色谱图
1.3 样品处理
丹参样品粉碎，过0.172mm目筛，准确称取样品0.1g，置于50mL锥型瓶中，准确加入20mL的乙腈，置于高速匀浆机2000r/min匀浆萃取2.0min，取1.0mL的提取液，用0.45um针头过滤器过滤，进样2.0uL分析。
2 结果与讨论
2.1 流动相的选择
二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA属于菲醌类化合物，化合物极性中等，因此实验首先选择乙腈-水混合溶剂为流动相，采用反相温文尔雅相色谱法进行分离测定，色谱峰有明显拖尾现象，流动相中加入少量磷酸可抑制峰拖尾现象，所以实验考虑在流动相中加入少量H3PO4用来抑制峰的拖尾。当流动相中乙腈的比例为40%时样品中4种丹参酮类化合物可达到完全分离，因此，本实验选用40%的乙腈（内含0.1%的磷酸）为流动相。
2.2 检测波长的选择
二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的乙腈溶液的紫外可见吸收光谱表明，此4种化合物的吸收光谱和最大吸收波长存在明显差异，但在254nm处均有较大吸收，因此本实验选择了254um作为4组分的检测波长。
2.3 样品前处理
丹参酮类物质在乙腈中具有较大的溶解度，本实验中采用乙腈为提取溶剂。匀浆提取法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，已广泛应用于样品前处理[8-9]，因此实验选用匀浆法提取。实验结果表明，0.2g的样品用20mL的乙腈提取，高速勻浆机2000转/min提取只需2.0min可让样品中丹参酮类化合物完全溶出（收集残渣再提取1次已经没有丹参酮检出）；因此本实验选用高速匀浆法2000r/min提取2.0min。由于没有干扰峰，提取液可直接进样分析。
2.4 回归方程、相关系数及检测限
配制质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50ug/mL的丹参酮标准溶液，在选定测定条件下进样5.0uL，根据测得的峰面积A对应的质量浓度C进行线性回归，得到回归方程，再将最小质量浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样5.0uL，计算当信噪比S/N=3时所对应的标准溶液的浓度以确定检出限，结果见表1.
表1 回归方程、相关系数及检测限
2.5 精密度实验
样品按1.3所述样品前处理方法处理，然后按选定色谱条件进样分析，在相同条件下每样平行测定7次，相对标准偏差为2.1%，另取样品每天测定1次，连续测定7d，计算日间相对标准偏差为2.8%，说明方法日内精密度和日间精密度均满意。
2.6 回收率实验
称取相同样品2份，其中一份为对照，另一份加入已知量的丹参酮标样（3个加入量），通过加标样品测出量减去未加标样品测出量再除以标准加入量计算回收率，结果见表2。从表2可看出，样品的加标回收率均在91.5%-98.6%之间，方法回收率高。
2.7 样品分析结果
用该方法测定了不同丹参样品中的隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，样品按前述样品前处理的方法处理后按选定色谱条件进样分析，结果见表3。 3 结论
本方法采用匀浆法提取，超高效液相色谱法测定中药材丹参中的丹参酮，高速匀速法具有提取完全、效率高、能耗低等特点，所需时间明显少于回流提取、振荡浸取法和超声波浸取法。此外，本方法还采用超高效液相色谱技术，5min完成1个样品分析，和常规液相色谱法相比分离时间大大缩短，提高了工作效率。总之，本方法具有准确、快速、高灵敏度和高选择性的特点，能够适应大规模样品的快速分析要求。
参考文献：
[1] 徐艳萍.浅谈中药丹参中丹参酮的药理作用及临床应用研究进展[J].中国药物应用与监测,2002,11(3):36-38.
[2] 魏晓舒,胡英娟.毛细管气相色谱法测定复方丹参片中冰片含量[J].药物分析杂志,2005,25(12):1565-1566.
[3] 张静,颜耀东.薄层扫描法测定健脑益智胶囊中丹参酮ⅡA含量[J].解放军药学学报,2004，20(5):392-393.
[4] 邵林,郭庆梅,李明娟,等.不同产地丹参指标性成分和浸出物的含量测定[J].中华中医药学刊,2010,23(1):85-87.
[5] 唐小峦,李焕德.HPLC-UV/ESI-MS法分析丹参不同提取组分[J].中南药学,2008,6(6):707-711.
[6] 原文鹏,刘林娜,马双成.HPLC法测定山丹酮缓释片中丹参酮类成分的含量[J].中国药房,2008,19(9):681-682.
[7] 何丽仙,黄忠京,谭倪,等.HPLC芍药草混合煎与分煎的化学成分变化[J].云南师范大学学报：自然科学版,2009,29(6):32-35.
[8] 赵善仓,赵领军,谷小红,等.超高效液相色谱串联质谱法测定小麦籽粒中麦黄酮[J].分析化学,2009,37(6):873-876.
[9] 马强,白桦,王超,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定玩具中的16种致癌和致敏染料[J].分析化学,2010,38(1):51-56.
[10]甘宾宾,蔡卓,蒋世琼,等.超高效液相色谱在现代分析检验中的应用进展[J].中国卫生检验杂志,2008,18(5):955-957.
[11]刘梅,俞桂新,张勉,等.超高效液相色谱法同时测定丹参药材中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量[J].中国中药杂志,2008.33(3)319-321.
[12]徐祎然,李海燕,李银科,等.匀浆法提取-离子色谱法測定烟草中的糖[J].云南民族大学学报：自然科学版,2010,19(1):43-45.
[13]崔柱文,汤丹俞,李海燕,等.匀浆法提取-离子色谱法测定烟草中阴离子的研究[J].云南民族大学学报:自然科学版,2009,18(4):325-327.