【摘 要】
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目的构建人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)基因原核表达质粒,表达并纯化带有硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的Trx-Cys C融合蛋白,并制备抗人Trx-Cys C多克隆抗体。方法在不改变氨基
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目的构建人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)基因原核表达质粒,表达并纯化带有硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)的Trx-Cys C融合蛋白,并制备抗人Trx-Cys C多克隆抗体。方法在不改变氨基酸序列的前提下,对Cys C的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后,人工合成其序列,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-Cys C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose 6FF纯化后,免疫新西兰大白兔,制备抗人Cys C多克隆抗体,采用间接ELISA及Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确,获得的经同义密码子优化后的序列与预期一致;重组Cys C蛋白获得了可溶性表达,相对分子质量约为35 000,表达量约占菌体总蛋白的50%;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可被Cys C临床检测试剂盒所识别。制备的抗人Cys C多克隆抗体效价达1∶(5.12×106)以上,并能特异性识别市售Cys C蛋白。结论已成功原核表达并纯化了可溶性重组Cys C蛋白,并制备了高效价的抗人Cys C多克隆抗体,为进一步建立Cys C免疫学检测方法奠定了基础。
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