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【摘要】目的：研制抗感染纳米羟基磷灰石（nano-HA）药物缓释微球，为骨髓炎的治疗提供一新型的局部药物缓释系统（DDS）。方法：采用nano-HA为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇（PHBV/PEG），承载硫酸庆大霉素（GM）制成nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球，研究其结构及体外释药特性。结果：微球具有明显缓释作用，90 mg DDS体外释放实验显示第1天释放量为165.2 μg/mL，其后下降并以较低水平稳定释放，维持有效释药时间在28 d以上。
关键词：纳米羟基磷灰石；聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物；聚乙二醇；硫酸庆大霉素；局部药物释放系统
中图分类号：R965文献标识码：B文献编号：1671-4954（2010）11-818-03
Doi：10.3969/j.issn.1671-4954.2010.11.028
局部药物缓释系统（drug delivery system，DDS）因其在局部能达到高的药物浓度，同时血药浓度低，不造成毒副作用，为治疗骨髓炎提供了一条有效的治疗途径。首先应用于临床的局部载药系统是聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）庆大霉素珠[1]。本研究采用具有生物活性的纳米羟基磷灰石（nano-HA）为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇（PHBV/PEG），承载硫酸庆大霉素（GM）制成nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球，研究其体外释药特性，旨在为骨髓炎的治疗提供一新型的DDS。
1 材料和方法
1.1材料
nano-HA、PHBV、PEG由华南理工大学生物工程与材料学院提供。庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所，批号30326-200314。M-H培养皿购自法国生物梅里埃，由南方医科大学珠江医院检验科提供。标准菌珠金黄色葡萄球菌ATCC25923由南方医科大学珠江医院检验科提供。
1.2方法
1.2.1 nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球的制备
1.2.1.1 nano-HA-GM的制备将质量比为2∶1（GM：nano-HA）的庆大霉素药物溶于水，与nano-HA混合，在超声波中分散20 min，然后磁力搅拌70 h。停止搅拌后，将药物和nano-HA的混合液冻干，得白色冻干粉nano-HA-GM。
1.2.1.2 nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球的制备将白色冻干粉nano-HA-GM分散于PHBV/PEG（PEG20000与PHBV的质量比为2∶1）的二氯甲烷溶液中，冻干粉与PHBV/PEG的质量比为1∶4。然后迅速倒入到外水相中，其中含0.4％甲基纤维素。油相与水相的体积比为1：10，剧烈搅拌直到二氯甲烷挥发完全。然后离心、过滤、水洗，收集固体冷冻干燥，制备出白色粉沫状nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球。同法制备nano-HA-PHBV/PEG无药微球作为对照组。环氧乙烷消毒灭菌备用。
1.2.2 电镜观察将少量nano-HA、nano-HA-GM粉末和nano-HA-PHBV/PEG-GM微球加入有适量的无水乙醇溶液中，超声振荡10 min，然后将此悬浮液移到带微栅膜的铜网上，待乙醇完全挥发后，用JEOLTEm2010高分辨透射电子显微镜进行分析。nano-HA-PHBV/PEG-GM微球大小和表面形态电镜观察，微球铺在铝箔的粘性表面，微球的表面涂金后，即可在扫描电镜下观察微球形态。
1.2.3 微球的载药量取3个20 mg样品，溶于1 ml二氯甲烷，加入5 ml PBS溶液，剧烈振摇10 min，静置1 h，然后取上清液，按衍生化法测定356 nm紫外吸光度，计算出载体中药物含量平均值。
1.2.4 绘制庆大霉素浓度-抑菌环直径标准曲线
1.2.4.1 标准庆大霉素液的配置用pH 7.4的PBS缓冲液将庆大霉素稀释成系列标准液，浓度为2000、1600、1200、800、500、200、100、50、20、10、5 μg/ml。
1.2.4.2 K-B法抑菌实验取90 mm MH琼脂培养皿，每个平皿涂布0.5 U浊度金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。将直径为6 mm的无菌滤纸置入平皿中，每片滤纸加庆大霉素标准液10 μl，每个浓度3个样品，分别置于3个培养皿中，37 ℃培养24 h。游标卡尺测量各浓度抑菌环直径，取平均值。
1.2.4.3 绘制标准曲线用SPSS10.0统计软件包拟合庆大霉素浓度与抑菌环直径的半对数标准曲线。
1.2.5 体外释放实验
1.2.5.1 体外释放试验[2]取3个小瓶，每个瓶内放置90 mg nano-HA-PHBV/PEG-GM微球，加入0.1 mol pH 7.4的PBS液1 ml，37 ℃下浸泡24 h。吸除浸出液，药粒用PBS冲洗3次，更换PBS液，继续浸泡。按浸泡后第1、3、5、7、10、14、21、28 天留取浸出液，-30 ℃存放。等量nano-HA-PHBV/PEG微球浸兆方法如上。
1.2.5.2：抑菌实验按制作标准曲线的方法进行抑菌实验，游标卡尺测量抑菌环直径。
1.2.5.3：绘制释放曲线用标准曲线计算出各标本药物浓度，用SPSS10.0统计软件包绘制微球释药浓度与时间关系曲线。
2 结果
2.1 电镜观察结果和微球的载药量
2.1.1 电镜观察结果在透射电镜下可见：nano-HA为纳米相晶体颗粒，尺寸为20～60 nm（图1），nano-HA-GM由于晶体自然凝聚以及庆大霉素药物颗粒叠加在一起成为所谓的“二次颗粒”，其大小在100～300 nm（图2），nano-HA-PHBV/PEG-GM微球透射结构为PHBV/PEG膜包裹纳米级nano-HA-GM药粒形成微球（图3）。扫描电镜观察：制备的微球呈白色，形态大小均匀规整，微球粒径为5～100 μm，微球表面形态一致，表面为多孔呈皱缩结构（图4）。
2.1.2 载药量微球的载药量为8.6％。
2.2 标准曲线
根据实验结果绘制庆大霉素标准曲线，方程为：y=8.909x-1.041，r=0.998。
2.3 体外庆大霉素浓度的测定
3个试样中庆大霉素均能从药棒向PBS液中扩散，具有明显缓释作用。第1个24 h释放量最大，达165.2 μg/ml，以后逐渐减少，但2周时释放量又增大，为46.8 μg/ml，其后以较低浓度维持，第28天仍有8.5 μg/mL庆大霉素释放量，高于金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（2 μg/ml）。对照组无药物释放。
3 讨论
3.1 载药材料的选择
DDS传统的载体材料主要可分为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、无机盐材料、骨移植材料等。PMMA是最早被用作局部缓释药物的载体，曾被广泛的应用，在体内不降解，需二次取出，限制了其应用范围。目前应用的无机盐载体主要是生物陶瓷，常用的有羟基磷灰石陶瓷、磷酸三钙等。生物陶瓷主要的优点是其结构和骨相似，高的组织相容性，缺点是硬度大，不易塑型。骨移植材料包括自体骨、异体骨、异种骨，在成骨方面有着人工材料无法比拟的优势，但来源有限而且异体骨、异种骨有排斥反应。为探寻新型的DDS载体材料，本研究研制了一种具有nano-HA与PHBV/PEG复合体材料的DDS。HA为天然骨组织中主要的无机盐成分，有成骨活性，而且纳米HA有很大的比表面，因而有很强的吸附和承载药物的能力。常用的多聚物有聚乳酸（PLA、PLLA）、聚乙二醇（PEG）、聚羟基丁酸酯－羟基戊酸酯共聚物（PHBV）等，它们有良好的组织相容性，可降解，具有弹性，降解速度通过改变多聚物的亲水性和晶体结构来控制。由于这些特点，PHBV、PEG制成的DDS具有良好的药物缓释性能[3，4]。因此，该DDS符合治疗骨髓炎理想的DDS载体材料所应有的特点：良好的组织相容性、载药和缓释性能及成骨活性[5]。
3.2 体外释药的特点
治疗骨髓炎要求系统使用抗生素时间应该达到4～6周。该DDS在体外释药过程中无明显的突释现象，此特性可避免体内释药时全身毒副作用的发生，药物浓度随天数逐渐减小，同时有稳定的低浓度释药，释药时间达28 d以上。2周时药物浓度又升高，原因可能为PHBV/PEG缓释膜溶胀后孔隙增大，从而导致药物释放的加速。该DDS微球之所以能保持长时间的药物缓释，与它的结构有关。nano-HA- PHBV/PEG-GM缓释微球存在特殊结构：首先微米级球体内包含着纳米级药粒，由于微米球粒径远大于纳米球，在释药过程中药物透过球体路径较多，导致药物释出时间延长；其次内部nano-HA吸附作用会使药物释放速度缓慢，同时PHBV/PEG膜保证了水分进入和药物缓释，在微观结构上就形成了一个DDS单元，每个单元都具有载药缓释的基本性能，能有效地避免药物突释，保持长时间的药物缓释。
3.3 应用前景
DDS对模药的要求较为严格，抗菌剂应具有抗菌谱宽、亲水性、不良反应小以及对热稳定等特点，以适应制造工艺要求。nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球制备过程简单，相对来说，拓宽了对抗生素的选择范围。基于慢性骨髓炎常为多种细菌感染引起，在进一步研究中，模药可选取更多抗菌谱广、效力强而毒副作用小的抗菌药物，例如氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类以及万古霉素等药物，以提高DDS对骨髓炎的治愈率。目前已研制的DDS形态许多为块状，实际应用中难以与骨腔完全贴敷，从而残留死腔，为骨髓炎的复发创造了条件。
nano-HA-PHBV/PEG-GM微球因体积小，在临床应用可以完全充填骨髓炎病灶残腔，以便于更充分的在局部释放有效的药物浓度，从而有广泛的应用前景。
【参考文献】
[1]Buchholz H，Chekofsky K，Brause B，et al.Depot effects of various antibiotics mixed with places resins[J].Chirurg，1970，41：511-5.
[2]陈爱民，侯春林，屠开元.几丁糖庆大霉素药物释放系统的研制及体外释放实验[J].中华骨科杂志，1997，17（9）：591-3.
[3]陈建海，陈志良，侯连兵，等.以PHBV/PLA为载体的地西泮缓释微球体外释放度的研究[J].中国药科大学学报，2000，31（1）：11-4.
[4]Huang YY，Chung TW.Microencapsulation of gentamicin in bio- degradable PLA and/or PLA/PEGcopolymer[J].J Microencapsul，2001，18（4）：457-65.
[5]Winkler H，Janata O，Berger C，et al.In vitrorelease of vancomycin and tobramycin from impregnated human and bovine bone grafts[J].J Antimicrob Chemother，2000，46：423-8.
关键词：纳米羟基磷灰石；聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物；聚乙二醇；硫酸庆大霉素；局部药物释放系统
中图分类号：R965文献标识码：B文献编号：1671-4954（2010）11-818-03
Doi：10.3969/j.issn.1671-4954.2010.11.028
局部药物缓释系统（drug delivery system，DDS）因其在局部能达到高的药物浓度，同时血药浓度低，不造成毒副作用，为治疗骨髓炎提供了一条有效的治疗途径。首先应用于临床的局部载药系统是聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）庆大霉素珠[1]。本研究采用具有生物活性的纳米羟基磷灰石（nano-HA）为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇（PHBV/PEG），承载硫酸庆大霉素（GM）制成nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球，研究其体外释药特性，旨在为骨髓炎的治疗提供一新型的DDS。
1 材料和方法
1.1材料
nano-HA、PHBV、PEG由华南理工大学生物工程与材料学院提供。庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所，批号30326-200314。M-H培养皿购自法国生物梅里埃，由南方医科大学珠江医院检验科提供。标准菌珠金黄色葡萄球菌ATCC25923由南方医科大学珠江医院检验科提供。
1.2方法
1.2.1 nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球的制备
1.2.1.1 nano-HA-GM的制备将质量比为2∶1（GM：nano-HA）的庆大霉素药物溶于水，与nano-HA混合，在超声波中分散20 min，然后磁力搅拌70 h。停止搅拌后，将药物和nano-HA的混合液冻干，得白色冻干粉nano-HA-GM。
1.2.1.2 nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球的制备将白色冻干粉nano-HA-GM分散于PHBV/PEG（PEG20000与PHBV的质量比为2∶1）的二氯甲烷溶液中，冻干粉与PHBV/PEG的质量比为1∶4。然后迅速倒入到外水相中，其中含0.4％甲基纤维素。油相与水相的体积比为1：10，剧烈搅拌直到二氯甲烷挥发完全。然后离心、过滤、水洗，收集固体冷冻干燥，制备出白色粉沫状nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球。同法制备nano-HA-PHBV/PEG无药微球作为对照组。环氧乙烷消毒灭菌备用。
1.2.2 电镜观察将少量nano-HA、nano-HA-GM粉末和nano-HA-PHBV/PEG-GM微球加入有适量的无水乙醇溶液中，超声振荡10 min，然后将此悬浮液移到带微栅膜的铜网上，待乙醇完全挥发后，用JEOLTEm2010高分辨透射电子显微镜进行分析。nano-HA-PHBV/PEG-GM微球大小和表面形态电镜观察，微球铺在铝箔的粘性表面，微球的表面涂金后，即可在扫描电镜下观察微球形态。
1.2.3 微球的载药量取3个20 mg样品，溶于1 ml二氯甲烷，加入5 ml PBS溶液，剧烈振摇10 min，静置1 h，然后取上清液，按衍生化法测定356 nm紫外吸光度，计算出载体中药物含量平均值。
1.2.4 绘制庆大霉素浓度-抑菌环直径标准曲线
1.2.4.1 标准庆大霉素液的配置用pH 7.4的PBS缓冲液将庆大霉素稀释成系列标准液，浓度为2000、1600、1200、800、500、200、100、50、20、10、5 μg/ml。
1.2.4.2 K-B法抑菌实验取90 mm MH琼脂培养皿，每个平皿涂布0.5 U浊度金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。将直径为6 mm的无菌滤纸置入平皿中，每片滤纸加庆大霉素标准液10 μl，每个浓度3个样品，分别置于3个培养皿中，37 ℃培养24 h。游标卡尺测量各浓度抑菌环直径，取平均值。
1.2.4.3 绘制标准曲线用SPSS10.0统计软件包拟合庆大霉素浓度与抑菌环直径的半对数标准曲线。
1.2.5 体外释放实验
1.2.5.1 体外释放试验[2]取3个小瓶，每个瓶内放置90 mg nano-HA-PHBV/PEG-GM微球，加入0.1 mol pH 7.4的PBS液1 ml，37 ℃下浸泡24 h。吸除浸出液，药粒用PBS冲洗3次，更换PBS液，继续浸泡。按浸泡后第1、3、5、7、10、14、21、28 天留取浸出液，-30 ℃存放。等量nano-HA-PHBV/PEG微球浸兆方法如上。
1.2.5.2：抑菌实验按制作标准曲线的方法进行抑菌实验，游标卡尺测量抑菌环直径。
1.2.5.3：绘制释放曲线用标准曲线计算出各标本药物浓度，用SPSS10.0统计软件包绘制微球释药浓度与时间关系曲线。
2 结果
2.1 电镜观察结果和微球的载药量
2.1.1 电镜观察结果在透射电镜下可见：nano-HA为纳米相晶体颗粒，尺寸为20～60 nm（图1），nano-HA-GM由于晶体自然凝聚以及庆大霉素药物颗粒叠加在一起成为所谓的“二次颗粒”，其大小在100～300 nm（图2），nano-HA-PHBV/PEG-GM微球透射结构为PHBV/PEG膜包裹纳米级nano-HA-GM药粒形成微球（图3）。扫描电镜观察：制备的微球呈白色，形态大小均匀规整，微球粒径为5～100 μm，微球表面形态一致，表面为多孔呈皱缩结构（图4）。
2.1.2 载药量微球的载药量为8.6％。
2.2 标准曲线
根据实验结果绘制庆大霉素标准曲线，方程为：y=8.909x-1.041，r=0.998。
2.3 体外庆大霉素浓度的测定
3个试样中庆大霉素均能从药棒向PBS液中扩散，具有明显缓释作用。第1个24 h释放量最大，达165.2 μg/ml，以后逐渐减少，但2周时释放量又增大，为46.8 μg/ml，其后以较低浓度维持，第28天仍有8.5 μg/mL庆大霉素释放量，高于金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（2 μg/ml）。对照组无药物释放。
3 讨论
3.1 载药材料的选择
DDS传统的载体材料主要可分为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、无机盐材料、骨移植材料等。PMMA是最早被用作局部缓释药物的载体，曾被广泛的应用，在体内不降解，需二次取出，限制了其应用范围。目前应用的无机盐载体主要是生物陶瓷，常用的有羟基磷灰石陶瓷、磷酸三钙等。生物陶瓷主要的优点是其结构和骨相似，高的组织相容性，缺点是硬度大，不易塑型。骨移植材料包括自体骨、异体骨、异种骨，在成骨方面有着人工材料无法比拟的优势，但来源有限而且异体骨、异种骨有排斥反应。为探寻新型的DDS载体材料，本研究研制了一种具有nano-HA与PHBV/PEG复合体材料的DDS。HA为天然骨组织中主要的无机盐成分，有成骨活性，而且纳米HA有很大的比表面，因而有很强的吸附和承载药物的能力。常用的多聚物有聚乳酸（PLA、PLLA）、聚乙二醇（PEG）、聚羟基丁酸酯－羟基戊酸酯共聚物（PHBV）等，它们有良好的组织相容性，可降解，具有弹性，降解速度通过改变多聚物的亲水性和晶体结构来控制。由于这些特点，PHBV、PEG制成的DDS具有良好的药物缓释性能[3，4]。因此，该DDS符合治疗骨髓炎理想的DDS载体材料所应有的特点：良好的组织相容性、载药和缓释性能及成骨活性[5]。
3.2 体外释药的特点
治疗骨髓炎要求系统使用抗生素时间应该达到4～6周。该DDS在体外释药过程中无明显的突释现象，此特性可避免体内释药时全身毒副作用的发生，药物浓度随天数逐渐减小，同时有稳定的低浓度释药，释药时间达28 d以上。2周时药物浓度又升高，原因可能为PHBV/PEG缓释膜溶胀后孔隙增大，从而导致药物释放的加速。该DDS微球之所以能保持长时间的药物缓释，与它的结构有关。nano-HA- PHBV/PEG-GM缓释微球存在特殊结构：首先微米级球体内包含着纳米级药粒，由于微米球粒径远大于纳米球，在释药过程中药物透过球体路径较多，导致药物释出时间延长；其次内部nano-HA吸附作用会使药物释放速度缓慢，同时PHBV/PEG膜保证了水分进入和药物缓释，在微观结构上就形成了一个DDS单元，每个单元都具有载药缓释的基本性能，能有效地避免药物突释，保持长时间的药物缓释。
3.3 应用前景
DDS对模药的要求较为严格，抗菌剂应具有抗菌谱宽、亲水性、不良反应小以及对热稳定等特点，以适应制造工艺要求。nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球制备过程简单，相对来说，拓宽了对抗生素的选择范围。基于慢性骨髓炎常为多种细菌感染引起，在进一步研究中，模药可选取更多抗菌谱广、效力强而毒副作用小的抗菌药物，例如氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类以及万古霉素等药物，以提高DDS对骨髓炎的治愈率。目前已研制的DDS形态许多为块状，实际应用中难以与骨腔完全贴敷，从而残留死腔，为骨髓炎的复发创造了条件。
nano-HA-PHBV/PEG-GM微球因体积小，在临床应用可以完全充填骨髓炎病灶残腔，以便于更充分的在局部释放有效的药物浓度，从而有广泛的应用前景。
【参考文献】
[1]Buchholz H，Chekofsky K，Brause B，et al.Depot effects of various antibiotics mixed with places resins[J].Chirurg，1970，41：511-5.
[2]陈爱民，侯春林，屠开元.几丁糖庆大霉素药物释放系统的研制及体外释放实验[J].中华骨科杂志，1997，17（9）：591-3.
[3]陈建海，陈志良，侯连兵，等.以PHBV/PLA为载体的地西泮缓释微球体外释放度的研究[J].中国药科大学学报，2000，31（1）：11-4.
[4]Huang YY，Chung TW.Microencapsulation of gentamicin in bio- degradable PLA and/or PLA/PEGcopolymer[J].J Microencapsul，2001，18（4）：457-65.
[5]Winkler H，Janata O，Berger C，et al.In vitrorelease of vancomycin and tobramycin from impregnated human and bovine bone grafts[J].J Antimicrob Chemother，2000，46：423-8.