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摘 要 目的：探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA及透明质酸的影响。方法：用含／未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞，RT—PCR检测透明质酸合酶mRNA表达，放免法检测培养上清液中透明质酸含量。结果：用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRN表达及培养上清液中透明质酸含量高于未含黄芪的培养液培养的细胞，且差异有统计学意义(P＜0．05)。结论：黄芪能上调糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达和促进透明质酸的合成。
关键词 黄芪 糖尿病足 成纤维细胞 透明质酸合酶 透明质酸
正常伤口的修复包括炎症、增生和修复三个阶段，在伤口愈合过程中，稳定细胞和不稳定细胞都具有完全的再生能力，但能否重新构建为正常结构尚依赖细胞外基质，透明质酸作为细胞外基质的主要成分，主要由成纤维细胞分泌[1]；本实验体外用黄芪作用糖尿病足溃疡处成纤维细胞，通过检测成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸的分泌量，旨在探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的影响。
1 材料和方法
1．1 材料与主要试剂 黄芪注射液(成都地奥公司)，TRizolReagent Total RNA lsolation Reagent(GiBco公司)，cDNA第一链合成Kit(上海生物工程公司)、dNTP、Tag DNA聚合酶、引物合成(上海生物工程公司)，DE-PC、DNA marker(华美生物公司)，胎牛血清(四季清公司)，异丙醇等常用化学试剂(Sigma公司或国产分析纯)；透明质酸放射免疫检测试剂盒(上海海研所)。透明质酸合酶引物正／负链序列：5’AAACCGCTCGAA—CAAGTC3和5’AACCCTGALGC-CAATCAAA3’，GAPDH引物正／负链序列：5’TGCTTTCCGTCG—TATCCA3’和5’CACCGTCAGTAGC—CCAGT3’，扩增片段大小分别为175和221 bp。
1．2 方法
1．2．1 成纤维细胞培养 取溃疡创面组织，经0．01mg／L新洁尔灭浸泡10min后生理盐水漂洗，剪成1mm3大小，贴壁2h后将组织块培养于含100ml／L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，体积分数为5％CO2，细胞生长至对数生长期后，将细胞悬液调整至1×107／L，移入24孔板中培养，待细胞贴壁后用含／未含20g／L黄芪的培养液进行培养，待瓶底长满细胞后，以2．5mg／L胰酶消化传代，培养6天后，收集细胞作相应检测。
1．2．2半定量RT—PCR检测透明质酸合酶mRNA表达 细胞RNA的提取按TRizol Reagent试剂盒说明书进行；用cDNA第一链合成Kit将RNA逆转录为cD—NA，按试剂盒说明书进行；半定量PCR反应扩增透明质酸合酶mRNA：PCR反应体系(50μl)：10×PCR Buffer(5．0μl)，25mMMgCl2(3．0μl)，4×dNTP(3．0μl)，透明质酸合酶20uM引物正链(1．5μl)，20uM引物负链(1．5μl)，②GAPDH20uM引物正链(0．75μl)，20uM引物负链(0．75μl)，cDNA(2．0μl)，5U／μlTag(0．8μl)，H2O(33．2μl)。半定量RT—PCR反应(同一管内进行)；PCR反应条件：透明质酸合酶mRNA扩增：先加透明质酸合酶引物(1．5μl+1．5μl)，95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；GAPDH加入：取上述产品加GAPDH引物(0．75μl+0．75μl)，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；PCR产物各取10μl用1．5g／L琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色观察。一次性成像系统照相，各条带的光密度值用彩色图像摄录输入仪(型号：JVCky—F30B 3—CCD)输入，德国KONTRONLBAS 2．0全自动图像分析系统进行分析，分析结果用透明质酸合酶／GAPDH计算得到透明质酸合酶mRNA表达的半定量结果。
1．2．3 体外合成透明质酸含量的测定 留取用含／未含20g／L黄芪的培养液进行细胞培养后每次换液的上清液，用全自动γ计数仪检测透明质酸含量，操作按试剂盒说明书进行。
1．3 统计学方法 计量资料用x±s表示，差异比较采用配对t检验。
2 结果
含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达RT—PCR结果分析，将用含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞mRNA与内参照GAPDH于同一条件下同时扩增，其扩增产物强度经电泳后图象分析，结果表明，用含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达均明显高于未含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞的表达，结果经t检验比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，具体结果见表1。
3 讨论
糖尿病溃疡久治不愈，机理十分复杂，至今尚不完全清楚，成纤维细胞功能低下是其中的原因之一[2]，临床观察发现用黄芪治疗糖尿病足溃疡，能加速溃疡的愈合[3]。同时对黄芪促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用进行了研究，从细胞学、蛋白及分子水平观察细胞形态、增殖特性、细胞周期，免疫组织化学方法检测PCNA蛋白表达，半定量RT—PCR检测P21WAFlmRNA的表达。黄芪作用后成纤维细胞形态趋于正常，细胞倍增时间缩短，C1期阻滞率降低，PCNA蛋白表达增高，P21WAFlmRNA的表达上调将近4倍，证实黄芪可促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞形态修复及细胞增殖[4]。
在损伤修复的肉芽组织形成过程中，肉芽组织中的基质主要为透明质酸和硫酸软骨素，主要是由成纤维细胞合成[5]；透明质酸作为细胞外基质的主要成分之一，它通过与细胞膜受体相结合而影响细胞的生物学活性，并与细胞的有丝分裂密切相关，溃疡愈合的速度及程度与成纤维细胞分泌透明质酸的量有直接的关系，透明质酸的增高可以促进伤口愈合，当透明质酸增高到一定限度时，愈合过程就表现为瘢痕的异常增生而成增生性瘢痕[6]；成纤维细胞功能低下而使透明质酸分泌量减低可能是糖尿病溃疡难愈合的原因之一；Bertheim等对正常 皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞分泌的透明质酸进行比较，发现后者的透明质酸的含量显著高于前者，用免疫组织化学染色方法也支持这一结果，增生性瘢痕中的透明质酸明显强于正常皮肤[7]。本实验用含／未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞，结果用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸高于未含黄芪的培养液培养的细胞，且差异有统计学意义(P＜0．05)，说明黄芪能通过上调成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达，而使透明质酸分泌量增高，有利于伤口肉芽组织的形成，加速伤口的愈合。从一侧面证实黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的恢复有一定的影响。
参考文献
1 Wayne KS，Alexander GD，GordonRT，et al．Physiology and healing dynamics ofchronic cutaneous wound[J]．Am J Surg，1998．179(1)：26
2 Mingardi R，Pasqualetti P，Strazza-bosco M，et al．Risk factor for ulceration，am—putahon and death：long team prospective study[M]．Abstract volume of the 36thannual meetingof EASD：A243 2000 Jerusalem．
3 肖正化，陈定宇，周倩，等．黄芪注射液加胰岛素混合液外敷治疗糖尿病足溃疡69例疗效观察．新中医，2005，21(6)
4 邓家德，李扬，肖正华，等．黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用的研究(J)．江西医学检验，2005，23(5)：389
5 李玉林．病理学。人民卫生出版社，16
6 Messadi DV，Bertolami CN．CD44and hyaluronan expression in human cutaneousscar fibroblasts[J]．AN J Pathol，1993，142(2)：1041
7 Bertheim U，Hellstrom S．The distri-bution of hyaluronan in human skin and mature．Hypertriphic and kejoid scars[J]。Br J PlastSurg，1994，47(1)：483
(收稿日期：2006年11月26日)
关键词 黄芪 糖尿病足 成纤维细胞 透明质酸合酶 透明质酸
正常伤口的修复包括炎症、增生和修复三个阶段，在伤口愈合过程中，稳定细胞和不稳定细胞都具有完全的再生能力，但能否重新构建为正常结构尚依赖细胞外基质，透明质酸作为细胞外基质的主要成分，主要由成纤维细胞分泌[1]；本实验体外用黄芪作用糖尿病足溃疡处成纤维细胞，通过检测成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸的分泌量，旨在探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的影响。
1 材料和方法
1．1 材料与主要试剂 黄芪注射液(成都地奥公司)，TRizolReagent Total RNA lsolation Reagent(GiBco公司)，cDNA第一链合成Kit(上海生物工程公司)、dNTP、Tag DNA聚合酶、引物合成(上海生物工程公司)，DE-PC、DNA marker(华美生物公司)，胎牛血清(四季清公司)，异丙醇等常用化学试剂(Sigma公司或国产分析纯)；透明质酸放射免疫检测试剂盒(上海海研所)。透明质酸合酶引物正／负链序列：5’AAACCGCTCGAA—CAAGTC3和5’AACCCTGALGC-CAATCAAA3’，GAPDH引物正／负链序列：5’TGCTTTCCGTCG—TATCCA3’和5’CACCGTCAGTAGC—CCAGT3’，扩增片段大小分别为175和221 bp。
1．2 方法
1．2．1 成纤维细胞培养 取溃疡创面组织，经0．01mg／L新洁尔灭浸泡10min后生理盐水漂洗，剪成1mm3大小，贴壁2h后将组织块培养于含100ml／L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃，体积分数为5％CO2，细胞生长至对数生长期后，将细胞悬液调整至1×107／L，移入24孔板中培养，待细胞贴壁后用含／未含20g／L黄芪的培养液进行培养，待瓶底长满细胞后，以2．5mg／L胰酶消化传代，培养6天后，收集细胞作相应检测。
1．2．2半定量RT—PCR检测透明质酸合酶mRNA表达 细胞RNA的提取按TRizol Reagent试剂盒说明书进行；用cDNA第一链合成Kit将RNA逆转录为cD—NA，按试剂盒说明书进行；半定量PCR反应扩增透明质酸合酶mRNA：PCR反应体系(50μl)：10×PCR Buffer(5．0μl)，25mMMgCl2(3．0μl)，4×dNTP(3．0μl)，透明质酸合酶20uM引物正链(1．5μl)，20uM引物负链(1．5μl)，②GAPDH20uM引物正链(0．75μl)，20uM引物负链(0．75μl)，cDNA(2．0μl)，5U／μlTag(0．8μl)，H2O(33．2μl)。半定量RT—PCR反应(同一管内进行)；PCR反应条件：透明质酸合酶mRNA扩增：先加透明质酸合酶引物(1．5μl+1．5μl)，95℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；GAPDH加入：取上述产品加GAPDH引物(0．75μl+0．75μl)，94℃变性1min，50℃退火50s，72℃延伸1min，15cycle；PCR产物各取10μl用1．5g／L琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色观察。一次性成像系统照相，各条带的光密度值用彩色图像摄录输入仪(型号：JVCky—F30B 3—CCD)输入，德国KONTRONLBAS 2．0全自动图像分析系统进行分析，分析结果用透明质酸合酶／GAPDH计算得到透明质酸合酶mRNA表达的半定量结果。
1．2．3 体外合成透明质酸含量的测定 留取用含／未含20g／L黄芪的培养液进行细胞培养后每次换液的上清液，用全自动γ计数仪检测透明质酸含量，操作按试剂盒说明书进行。
1．3 统计学方法 计量资料用x±s表示，差异比较采用配对t检验。
2 结果
含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达RT—PCR结果分析，将用含／未含黄芪的培养液培养后的成纤维细胞mRNA与内参照GAPDH于同一条件下同时扩增，其扩增产物强度经电泳后图象分析，结果表明，用含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞透明质酸合成酶mRNA表达均明显高于未含黄芪的培养液进行培养后的成纤维细胞的表达，结果经t检验比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，具体结果见表1。
3 讨论
糖尿病溃疡久治不愈，机理十分复杂，至今尚不完全清楚，成纤维细胞功能低下是其中的原因之一[2]，临床观察发现用黄芪治疗糖尿病足溃疡，能加速溃疡的愈合[3]。同时对黄芪促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用进行了研究，从细胞学、蛋白及分子水平观察细胞形态、增殖特性、细胞周期，免疫组织化学方法检测PCNA蛋白表达，半定量RT—PCR检测P21WAFlmRNA的表达。黄芪作用后成纤维细胞形态趋于正常，细胞倍增时间缩短，C1期阻滞率降低，PCNA蛋白表达增高，P21WAFlmRNA的表达上调将近4倍，证实黄芪可促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞形态修复及细胞增殖[4]。
在损伤修复的肉芽组织形成过程中，肉芽组织中的基质主要为透明质酸和硫酸软骨素，主要是由成纤维细胞合成[5]；透明质酸作为细胞外基质的主要成分之一，它通过与细胞膜受体相结合而影响细胞的生物学活性，并与细胞的有丝分裂密切相关，溃疡愈合的速度及程度与成纤维细胞分泌透明质酸的量有直接的关系，透明质酸的增高可以促进伤口愈合，当透明质酸增高到一定限度时，愈合过程就表现为瘢痕的异常增生而成增生性瘢痕[6]；成纤维细胞功能低下而使透明质酸分泌量减低可能是糖尿病溃疡难愈合的原因之一；Bertheim等对正常 皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞分泌的透明质酸进行比较，发现后者的透明质酸的含量显著高于前者，用免疫组织化学染色方法也支持这一结果，增生性瘢痕中的透明质酸明显强于正常皮肤[7]。本实验用含／未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞，结果用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达及透明质酸高于未含黄芪的培养液培养的细胞，且差异有统计学意义(P＜0．05)，说明黄芪能通过上调成纤维细胞透明质酸合酶mRNA表达，而使透明质酸分泌量增高，有利于伤口肉芽组织的形成，加速伤口的愈合。从一侧面证实黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞功能的恢复有一定的影响。
参考文献
1 Wayne KS，Alexander GD，GordonRT，et al．Physiology and healing dynamics ofchronic cutaneous wound[J]．Am J Surg，1998．179(1)：26
2 Mingardi R，Pasqualetti P，Strazza-bosco M，et al．Risk factor for ulceration，am—putahon and death：long team prospective study[M]．Abstract volume of the 36thannual meetingof EASD：A243 2000 Jerusalem．
3 肖正化，陈定宇，周倩，等．黄芪注射液加胰岛素混合液外敷治疗糖尿病足溃疡69例疗效观察．新中医，2005，21(6)
4 邓家德，李扬，肖正华，等．黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖作用的研究(J)．江西医学检验，2005，23(5)：389
5 李玉林．病理学。人民卫生出版社，16
6 Messadi DV，Bertolami CN．CD44and hyaluronan expression in human cutaneousscar fibroblasts[J]．AN J Pathol，1993，142(2)：1041
7 Bertheim U，Hellstrom S．The distri-bution of hyaluronan in human skin and mature．Hypertriphic and kejoid scars[J]。Br J PlastSurg，1994，47(1)：483
(收稿日期：2006年11月26日)