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摘要：文章旨在研究热处理对β-伴大豆球蛋白的二级结构的影响，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合SDS-PAGE凝胶电泳，Native-PAGE凝胶电泳研究了β-伴大豆球蛋白在热处理下的二级结构变化。研究结果表明，在60℃～100℃处理下，随温度升高，β-伴大豆球蛋白的二级结构中的α-螺旋呈下降趋势，β折叠总体呈升高趋势，β-转角呈下降趋势，无规卷曲呈升高趋势。
关键词：大豆β-伴球蛋白；温度；SDS-PAGE；Native-PAGE；傅里叶变换红外光谱；二级结构
中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0079-2
基金项目：本文系吉林省科技厅青年基金项目，项目编号：201101119。
大豆蛋白是人类摄食的重要蛋白来源之一，其资源丰富、营养价值高、原料成本低，近年来被广泛应用在食品工业中。大豆中约含35%～40%的蛋白质，根据其沉降系数的不同可分为四大类，分别为2S、7S、11S和15S组分。[1-2]大豆β-伴球蛋白是7S组分中的主要成分，又称7S球蛋白，约占大豆中蛋白质总量的20%～30%。大豆β-伴球蛋白对大豆蛋白的乳化性等功能特性和营养品质均起到重要作用。[3-5]
天然大豆蛋白分子结构紧密，大量酶切位点藏于蛋白质分子内部，很难被蛋白酶水解，对大豆蛋白进行变性处理，会使酶解位点大大增加。[6]经过热处理后的蛋白质其构象改变，结构展开，变得对酶更加敏感。蛋白质在变性过程中，其二级结构会发生变化，检测这些变化的方法很多，目前常用的光谱法有圆二色谱法（CD）、荧光光谱法、X射线衍射法（X-ray）和傅里叶变换红外光谱法（FTIR）等，其中FTIR是最近20年发展起来的一种新的分析測试技术。[7]本文以FTIR是为主要手段并结合SDS-PAGE凝胶电泳和Native-PAGE凝胶电泳探讨温度变化对大豆β-伴球蛋白二级结构的影响，并对今后的研究进行合理的设想和探索。
1 材料与方法
1.1 供试材料
实验大豆购自吉林农业大学春雨种子有限公司。
1.2 主要仪器
85-2控温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、PHS-3C型酸度计（上海伟业仪器厂）、层析柱（110cm× 4.5cm）、高速低温冷冻离心机（Sigma）、BS-160型自动收集器（上海沪西分析仪器厂）。
BIO-RAD电泳系统：美国BIO-RAD公司、岛津FTIR-8400s傅立叶变换红外光谱仪。
1.3 主要试剂
甲叉双丙烯酰胺：Fluka分装，小牛腱Ⅰ型胶原蛋白：Sigma公司，考马斯亮兰R-250：Sigma公司，次高分子量蛋白质标准品：上海伯奥生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯。
1.4 试验方法
1.4.1 伴大豆球蛋白样品的制备 参考赵元[8]法，本试验采用等电点沉淀法、盐析法及琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B层析体系制备和纯化β-Conglycinin样品，以供后续体外试验所需。
1.4.2 大豆β-伴大豆球蛋白样品处理 将7S冻干粉溶于ph7.5的磷酸盐缓冲液中并用预先设定的温度梯度进行标记，分别放入60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中加热处理。
1.4.3 Native-PAGE凝胶电泳 采用SDS-PAGE垂直电泳，7.5%的分离胶；2.5%的浓缩胶；电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）；样品缓冲液为0.05mol·L-1pH8.0 Tris-HCL缓冲液；0.25%的考马斯亮兰R-250甲醇水染色液；酸甲醇水脱色液（7.5%的甲醇、5%的冰醋酸）。
取样品15ul溶于15ul样品缓冲液，3000r·min-1离心3min后上样。采用直流恒压电源：浓缩胶电压为80V，分离胶电压为160V，电泳时间2～3h。
1.4.4 SDS-PAGE凝胶电泳 采用SDS-PAGE垂直电泳，12%的分离胶；5%的浓缩胶；电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.3，含0.1%SDS）；样品缓冲液为0.05mol·L-1pH8.0 Tris-HCL缓冲液（含2%SDS，5%β-ME、10%甘油和0.02%的溴酚兰）；0.25%的考马斯亮兰R-250甲醇水染色液；酸甲醇水脱色液（7.5%的甲醇、5%的冰醋酸）。
取经过热处理后样品15ul溶于15ul样品缓冲液，100℃加热5min，3000r·min-1离心3min后上样。采用直流恒压电源：浓缩胶电压为100V，分离胶电压为200V，电泳时间1～2h。
1.4.5 傅里叶红外分析 取大豆β-伴大豆球蛋白溶液加入到KBr盐窗内，样品厚度为0.05ul，将样品池置于红外光谱仪的样品室内，并获得FTIR红外谱图。红外光谱仪为岛津FTIR-8400s傅立叶变换红外光谱仪，扫描范围为400～4000cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数40次。
2 结果与分析
2.1 Native-PAGE凝胶电泳
不同浓度大豆蛋白水热处理产物的Native-PAGE（图2）。在样品槽中有大分子聚集体存在，在分离胶顶端还有另外一系列的聚集体。泳道N-70的条带非常深。泳道80～100的条带明显比泳道N-70深。说明当温度升高至80℃时，亚基基本以聚集体形式存在，而70～100时，依然有少量组分以亚基形式存在。与图1对应还原情况相比较，可以发现聚集体对应条带依然存在。
2.2 SDS-PAGE凝胶电泳
采用SDS-PAGE凝胶电泳分析了温度处理后β-伴大豆球蛋白的结构变化（图1），包括由二硫键生成而产生的聚集以及各亚基的解离等。电泳样品为蛋白marker（M）、未处理（N）、60℃-100℃处理，由电泳可以明显看出，在热处理的过程中，随温度的升高，顶部出现聚集的情况就越明显，但由于变性剂的作用，各亚基无明显的变化。 2.3 傅里叶红外分析
β伴大豆球蛋白在60～100℃下的红外吸收光谱（400～4000cm-1）取酰胺Ⅰ带1600～1700cm-1进行去卷积、多峰拟合等步骤处理（见图3）α螺旋峰位1650～1659cm-1，β折叠峰位1675，1639，1630，1618cm-1，β转角峰位1694，1681，1667cm-1。[15]各二级结构见表1所示α螺旋结构随温度的变化较大，β折叠的结构变化是一个比较复杂的过程。这些研究对于确定变性前后蛋白质结构的微观变化、蛋白质折叠和蛋白质的稳定性都特别重要。发现酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带都有变化，发现热处理后的β-伴大豆球蛋白相对于未处理蛋白质的α螺旋结构有不同程度的减少了，β折叠和β转角结构有所增加，无规卷曲结构有较大程度的增加了，其中80℃处理时α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲变化明显。与对照组相比，80℃处理组的α螺旋、β折叠和β转角含量降低，降幅范围分别为31.9%，6.6%和14.1%；无规卷曲含量增加，增幅范围为98%。
3 讨论
本文对β-伴大豆球蛋白的结构进行了初步研究，首先对β-伴大豆球蛋白热处理后各亚基聚集情况进行了研究，然后通过傅里叶红外光谱对经热处理的β-伴大豆球蛋白的二级结构进行分析，着重分析其热变形过程中，α螺旋，β折叠，β转角，无规卷曲的相对含量的变化。
SDS-PAGE凝胶电泳：在变性剂的作用下，凝胶中各亚基无明显变化，但在温度升高的过程中，明显看到从70℃开始泳道就出现聚集现象并逐渐加深。Native-PAGE凝胶电泳结果表明：70℃开始梳孔边缘出现非常明显的聚集体，亚基颜色也随着温度的升高而变浅，到达100℃时，亚基结构基本破坏，泳道中基本无条带，说明在热处理的过程中，β-伴大豆球蛋白各亚基结构改变，多变成无规卷曲等无序结构，呈聚集体形态。
FTIR红外光谱分析得到：在热处理过程中，随着温度变化，β-伴大豆球蛋白结构发生明显变化，β-伴大豆球蛋白在温度70-80℃时变化幅度最大，无规卷曲结构的最大增幅在90%以上，说明在热处理过程中，70℃～80℃为β-伴大豆球蛋白的变性温度，温度升高至80℃左右时，蛋白质的二级结构发生最大程度的变化，β-伴大豆球蛋白的刚性结构发生部分解离，变为无规则的柔性结构。
参考文献
[1] 王鹏，郭丽.大豆β-伴球蛋白的功能特性分析[J].粮油加工，2010，12（28）：135-138.
[2] 刘珊珊，武小霞，姜振峰，李文滨.大豆7S 球蛋白β-伴大豆球蛋白的研究现状[J].大豆科学， 2007，6（26）：417-422.
[3] 胡声迪，郭金枝，马曦.大豆β-伴大豆球蛋白研究进展[J].中国畜牧杂志，2010，46（5）：65-68.
[4] Coates JB，Medeiros JS，Thanh VH，et al.
Characterization of the subunits of β-conglycinin[J].Arch Biochem Biophysics，1985，243：184-1941.
[5] Hira T，Mori N，Nakamori T，Furuta H，Asano K，Chiba H，Hara H.Acute effect of soybean beta-conglycinin hydrolysate ingestion on appetite sensations in healthy humans[J].Appetite，2011，57：765-768.
[6] 黄惠华，高孔荣，郭乾初，梁汉华.大豆原料及其分离蛋白的SDS-PAGE 图谱研究[J].食品科学，2000，21（6）：15-18.
[7] 钟朝辉，李春美，顾海峰，窦宏亮，周丽明.温度对鱼鳞胶原蛋白二级结构的影响[J].光谱学与光谱分析，2007，10（27）：1970-1976.
[8] 赵元.大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在仔猪体内消化动力学的研究[D].吉林农业大学，2006.
[9] 贾振宝，郭令鸟，刘宁，霍贵成.大豆中β-伴球蛋白的分离与纯化[J].食品科学，2003，24（7）：31-33.
[10] LIU Chun，WANG Xiansheng，MA Hao，et al.Functional properties of protein isolates from soybeans stored under various conditions[J].Food Chemistry，2008，111：29-37.
[11] 石彦国.大豆制品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，
2009：61.
[12] 吴谨光.近代傅里叶变换红外光谱技术及应用[M].北京：科学技术文献出版社，1994：192.
[13] 高红艳，许强，杨志怀.FTIR在研究蛋白质二级结构中的应用[J].宝鸡文理学院学报（自然科学版），2009，9（29）：47-53.
[14] 卢雁，张玮玮，王公轲.FTIR用于变性蛋白质二级结构的研究进展[J].光谱学与光谱分析，2008，1（28）：88-93.
[15] Xiao yan Zhao，Fusheng Chen，Wentong Xue，Lite Lee.FTIR spectra studies on the secondary structures of 7S and 11S globulins from soybean proteins using AOT reverse micellar extraction，Food Hydrocolloids，2008（22）：568–575.
作者简介：李岩涛（1987-），男，吉林辽源人，吉林農业大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2010级硕士研究生，研究方向：生物大分子的营养与代谢。
网络出版时间：2013-3-28 15：00：05
网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20130328.1500.002.html
关键词：大豆β-伴球蛋白；温度；SDS-PAGE；Native-PAGE；傅里叶变换红外光谱；二级结构
中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2013）-04-0079-2
基金项目：本文系吉林省科技厅青年基金项目，项目编号：201101119。
大豆蛋白是人类摄食的重要蛋白来源之一，其资源丰富、营养价值高、原料成本低，近年来被广泛应用在食品工业中。大豆中约含35%～40%的蛋白质，根据其沉降系数的不同可分为四大类，分别为2S、7S、11S和15S组分。[1-2]大豆β-伴球蛋白是7S组分中的主要成分，又称7S球蛋白，约占大豆中蛋白质总量的20%～30%。大豆β-伴球蛋白对大豆蛋白的乳化性等功能特性和营养品质均起到重要作用。[3-5]
天然大豆蛋白分子结构紧密，大量酶切位点藏于蛋白质分子内部，很难被蛋白酶水解，对大豆蛋白进行变性处理，会使酶解位点大大增加。[6]经过热处理后的蛋白质其构象改变，结构展开，变得对酶更加敏感。蛋白质在变性过程中，其二级结构会发生变化，检测这些变化的方法很多，目前常用的光谱法有圆二色谱法（CD）、荧光光谱法、X射线衍射法（X-ray）和傅里叶变换红外光谱法（FTIR）等，其中FTIR是最近20年发展起来的一种新的分析測试技术。[7]本文以FTIR是为主要手段并结合SDS-PAGE凝胶电泳和Native-PAGE凝胶电泳探讨温度变化对大豆β-伴球蛋白二级结构的影响，并对今后的研究进行合理的设想和探索。
1 材料与方法
1.1 供试材料
实验大豆购自吉林农业大学春雨种子有限公司。
1.2 主要仪器
85-2控温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、PHS-3C型酸度计（上海伟业仪器厂）、层析柱（110cm× 4.5cm）、高速低温冷冻离心机（Sigma）、BS-160型自动收集器（上海沪西分析仪器厂）。
BIO-RAD电泳系统：美国BIO-RAD公司、岛津FTIR-8400s傅立叶变换红外光谱仪。
1.3 主要试剂
甲叉双丙烯酰胺：Fluka分装，小牛腱Ⅰ型胶原蛋白：Sigma公司，考马斯亮兰R-250：Sigma公司，次高分子量蛋白质标准品：上海伯奥生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯。
1.4 试验方法
1.4.1 伴大豆球蛋白样品的制备 参考赵元[8]法，本试验采用等电点沉淀法、盐析法及琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B层析体系制备和纯化β-Conglycinin样品，以供后续体外试验所需。
1.4.2 大豆β-伴大豆球蛋白样品处理 将7S冻干粉溶于ph7.5的磷酸盐缓冲液中并用预先设定的温度梯度进行标记，分别放入60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中加热处理。
1.4.3 Native-PAGE凝胶电泳 采用SDS-PAGE垂直电泳，7.5%的分离胶；2.5%的浓缩胶；电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）；样品缓冲液为0.05mol·L-1pH8.0 Tris-HCL缓冲液；0.25%的考马斯亮兰R-250甲醇水染色液；酸甲醇水脱色液（7.5%的甲醇、5%的冰醋酸）。
取样品15ul溶于15ul样品缓冲液，3000r·min-1离心3min后上样。采用直流恒压电源：浓缩胶电压为80V，分离胶电压为160V，电泳时间2～3h。
1.4.4 SDS-PAGE凝胶电泳 采用SDS-PAGE垂直电泳，12%的分离胶；5%的浓缩胶；电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH8.3，含0.1%SDS）；样品缓冲液为0.05mol·L-1pH8.0 Tris-HCL缓冲液（含2%SDS，5%β-ME、10%甘油和0.02%的溴酚兰）；0.25%的考马斯亮兰R-250甲醇水染色液；酸甲醇水脱色液（7.5%的甲醇、5%的冰醋酸）。
取经过热处理后样品15ul溶于15ul样品缓冲液，100℃加热5min，3000r·min-1离心3min后上样。采用直流恒压电源：浓缩胶电压为100V，分离胶电压为200V，电泳时间1～2h。
1.4.5 傅里叶红外分析 取大豆β-伴大豆球蛋白溶液加入到KBr盐窗内，样品厚度为0.05ul，将样品池置于红外光谱仪的样品室内，并获得FTIR红外谱图。红外光谱仪为岛津FTIR-8400s傅立叶变换红外光谱仪，扫描范围为400～4000cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数40次。
2 结果与分析
2.1 Native-PAGE凝胶电泳
不同浓度大豆蛋白水热处理产物的Native-PAGE（图2）。在样品槽中有大分子聚集体存在，在分离胶顶端还有另外一系列的聚集体。泳道N-70的条带非常深。泳道80～100的条带明显比泳道N-70深。说明当温度升高至80℃时，亚基基本以聚集体形式存在，而70～100时，依然有少量组分以亚基形式存在。与图1对应还原情况相比较，可以发现聚集体对应条带依然存在。
2.2 SDS-PAGE凝胶电泳
采用SDS-PAGE凝胶电泳分析了温度处理后β-伴大豆球蛋白的结构变化（图1），包括由二硫键生成而产生的聚集以及各亚基的解离等。电泳样品为蛋白marker（M）、未处理（N）、60℃-100℃处理，由电泳可以明显看出，在热处理的过程中，随温度的升高，顶部出现聚集的情况就越明显，但由于变性剂的作用，各亚基无明显的变化。 2.3 傅里叶红外分析
β伴大豆球蛋白在60～100℃下的红外吸收光谱（400～4000cm-1）取酰胺Ⅰ带1600～1700cm-1进行去卷积、多峰拟合等步骤处理（见图3）α螺旋峰位1650～1659cm-1，β折叠峰位1675，1639，1630，1618cm-1，β转角峰位1694，1681，1667cm-1。[15]各二级结构见表1所示α螺旋结构随温度的变化较大，β折叠的结构变化是一个比较复杂的过程。这些研究对于确定变性前后蛋白质结构的微观变化、蛋白质折叠和蛋白质的稳定性都特别重要。发现酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带都有变化，发现热处理后的β-伴大豆球蛋白相对于未处理蛋白质的α螺旋结构有不同程度的减少了，β折叠和β转角结构有所增加，无规卷曲结构有较大程度的增加了，其中80℃处理时α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲变化明显。与对照组相比，80℃处理组的α螺旋、β折叠和β转角含量降低，降幅范围分别为31.9%，6.6%和14.1%；无规卷曲含量增加，增幅范围为98%。
3 讨论
本文对β-伴大豆球蛋白的结构进行了初步研究，首先对β-伴大豆球蛋白热处理后各亚基聚集情况进行了研究，然后通过傅里叶红外光谱对经热处理的β-伴大豆球蛋白的二级结构进行分析，着重分析其热变形过程中，α螺旋，β折叠，β转角，无规卷曲的相对含量的变化。
SDS-PAGE凝胶电泳：在变性剂的作用下，凝胶中各亚基无明显变化，但在温度升高的过程中，明显看到从70℃开始泳道就出现聚集现象并逐渐加深。Native-PAGE凝胶电泳结果表明：70℃开始梳孔边缘出现非常明显的聚集体，亚基颜色也随着温度的升高而变浅，到达100℃时，亚基结构基本破坏，泳道中基本无条带，说明在热处理的过程中，β-伴大豆球蛋白各亚基结构改变，多变成无规卷曲等无序结构，呈聚集体形态。
FTIR红外光谱分析得到：在热处理过程中，随着温度变化，β-伴大豆球蛋白结构发生明显变化，β-伴大豆球蛋白在温度70-80℃时变化幅度最大，无规卷曲结构的最大增幅在90%以上，说明在热处理过程中，70℃～80℃为β-伴大豆球蛋白的变性温度，温度升高至80℃左右时，蛋白质的二级结构发生最大程度的变化，β-伴大豆球蛋白的刚性结构发生部分解离，变为无规则的柔性结构。
参考文献
[1] 王鹏，郭丽.大豆β-伴球蛋白的功能特性分析[J].粮油加工，2010，12（28）：135-138.
[2] 刘珊珊，武小霞，姜振峰，李文滨.大豆7S 球蛋白β-伴大豆球蛋白的研究现状[J].大豆科学， 2007，6（26）：417-422.
[3] 胡声迪，郭金枝，马曦.大豆β-伴大豆球蛋白研究进展[J].中国畜牧杂志，2010，46（5）：65-68.
[4] Coates JB，Medeiros JS，Thanh VH，et al.
Characterization of the subunits of β-conglycinin[J].Arch Biochem Biophysics，1985，243：184-1941.
[5] Hira T，Mori N，Nakamori T，Furuta H，Asano K，Chiba H，Hara H.Acute effect of soybean beta-conglycinin hydrolysate ingestion on appetite sensations in healthy humans[J].Appetite，2011，57：765-768.
[6] 黄惠华，高孔荣，郭乾初，梁汉华.大豆原料及其分离蛋白的SDS-PAGE 图谱研究[J].食品科学，2000，21（6）：15-18.
[7] 钟朝辉，李春美，顾海峰，窦宏亮，周丽明.温度对鱼鳞胶原蛋白二级结构的影响[J].光谱学与光谱分析，2007，10（27）：1970-1976.
[8] 赵元.大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白在仔猪体内消化动力学的研究[D].吉林农业大学，2006.
[9] 贾振宝，郭令鸟，刘宁，霍贵成.大豆中β-伴球蛋白的分离与纯化[J].食品科学，2003，24（7）：31-33.
[10] LIU Chun，WANG Xiansheng，MA Hao，et al.Functional properties of protein isolates from soybeans stored under various conditions[J].Food Chemistry，2008，111：29-37.
[11] 石彦国.大豆制品工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，
2009：61.
[12] 吴谨光.近代傅里叶变换红外光谱技术及应用[M].北京：科学技术文献出版社，1994：192.
[13] 高红艳，许强，杨志怀.FTIR在研究蛋白质二级结构中的应用[J].宝鸡文理学院学报（自然科学版），2009，9（29）：47-53.
[14] 卢雁，张玮玮，王公轲.FTIR用于变性蛋白质二级结构的研究进展[J].光谱学与光谱分析，2008，1（28）：88-93.
[15] Xiao yan Zhao，Fusheng Chen，Wentong Xue，Lite Lee.FTIR spectra studies on the secondary structures of 7S and 11S globulins from soybean proteins using AOT reverse micellar extraction，Food Hydrocolloids，2008（22）：568–575.
作者简介：李岩涛（1987-），男，吉林辽源人，吉林農业大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业2010级硕士研究生，研究方向：生物大分子的营养与代谢。
网络出版时间：2013-3-28 15：00：05
网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20130328.1500.002.html