【摘 要】
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旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体.收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24 h)和不同形态[有第1极体
【机 构】
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中国农业科学院广西水牛研究所/农业部(广西)水牛遗传繁育重点试验室,广西南宁,530001
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旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体.收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24 h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-qPCR检测其p21 mRNA相对表达量.同时利用RT-PCR技术从摩拉水牛卵巢颗粒细胞中扩增出p21基因编码序列,插入pEGFP-N1真核表达载体中,构建出重组质粒.将重组质粒pEGFP-N1-p21转染水牛颗粒细胞,并于培养24h和48h后观察转染细胞的荧光表达情况.收集转染48h后的颗粒细胞,通过RT-qPCR检测p21 mRNA相对表达量.结果显示,成熟培养6 h的卵母细胞p21 mRNA表达量显著高于成熟培养0、12、24 h的表达量(P<0.05),有PB1的卵母细胞中p21 mRNA的表达量显著高于无PB1的卵母细胞(P<0.05);重组质粒pEGFP-N1-p21转染颗粒细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-p21转染组的p21 mRNA表达量显著升高.结果表明,在体外成熟培养过程中均能检测到水牛卵母细胞p21 mRNA表达量,成功构建了摩拉水牛p21基因真核表达载体,为下一步研究p21基因在水牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的功能和调控奠定了基础.
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