论文部分内容阅读
摘要以随机采集的新鲜牛奶和培养的K562细胞为基础，配制不同细胞含量的待测奶样，并在10～1 000 Hz低频测试区域内使用多频电容测试技术对配制的不同奶样进行测试。结果表明，微通道传感器的牛奶细胞数检测下限可达40万个/mL；细胞体积电容值与细胞含量之间具有一定的线性相关性，细胞体积电容参数可以作为一个检测细胞含量的重要指标。
关键词微通道传感器；电容；细胞检测；牛奶
中图分类号S854.4+3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0010-02
AbstractBased on randomly collected fresh milk and cultured K562 cell，some milk samples with different cell contents were prepared，and tested by multifrequency capacitance testing technology within 10-1 000 Hz.Results showed as followed：the determination low limit of milk cell number of microchannel sensor could reach 200 thousand individuals per milliliter；the cell volume capacitance had certain linear relationship with cell content，so the cell volume capacitance could be as an important index for determining cell content.
Key wordsMicrochannel sensor；Capacitance；Cell determination；Milk
牛奶体细胞数是评价奶牛乳腺炎患病等级的重要标准之一，是预测新鲜牛奶产量和质量的重要量化指标[1]。因此，准确、快速地检测新鲜牛奶中的体细胞数非常重要。然而，在体细胞数的所有检测方法中，电检测法被公认为是同时具有检测成本低、快速准确、操作简单等众多优点的检测方法[2]。因此，研发具有检测准确、使用便捷、样品消耗少、能实现在线检测的微通道传感器有着很好的市场前景。
细胞具有完整的膜结构，当其被置于外电场中时，细胞膜内的自由离子在受到电场力的作用下会在细胞膜表面堆积，从而使细胞表现出微小的电容效应[3-4]。崔传金等[5]研究表明，乳汁的电容作为预测乳腺炎的新型参数是完全可行的。鉴于此，笔者采用微流控技术构建两电极微通道传感器，测取了不同细胞含量奶样的电容值，以达到诊断奶牛乳腺炎疾病的目的。
1材料与方法
1.1仪器美国GAMRY REFERENCE 600电化学工作站；美国HERA CELL 150i二氧化碳培养箱；日本OLYMPUS CKX301倒置显微镜；79-1磁力加热搅拌器（北京科伟永兴仪器有限公司）；DC-0515低温恒温槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BCD-219SKDE冷藏柜等。
1.2测试试验
1.2.1奶样采集。
奶样采自正常生理期内的同一头黑白花奶牛。采样时先用温开水擦拭乳头，然后用75%乙醇对乳头进行消毒，并用干净的医用棉签擦干，且弃去前2次挤出的牛奶，再进行奶样采集。每个乳区的牛奶分别挤入50 mL干净的带有编号的玻璃瓶内密封，在运输的过程中放入装有冰袋的隔热泡沫塑料盒内进行保鲜。最后将当天采集的奶样带回实验室测试，无法立刻测试的奶样需在4 ℃条件下冷藏保存，防止牛奶变质而影响测试效果。
1.2.2测试奶样的配制。
将采集回来的奶样放入低温恒温槽中，在40 ℃恒温条件下恒温15 min后取出[6]，用磁力加热搅拌器搅拌3 min，将奶样置入5 μm干净砂芯中进行负压过滤，去除新鲜牛奶中的杂质和原有体细胞，得到无细胞含量的奶样。
试验所需的体细胞用培养后的K562细胞进行替代[3]。将培养好的K562细胞与过滤后的无细胞奶样分别配制为40万、80万、160万、320万、640万个/mL的待测奶样，并进行碘酊染液染色、细胞计数板计数。测试时，同一奶样重复镜检计数3次，取其平均值作为最终细胞值含量。并根据加利福尼亚CMT标准[7]，将奶样划分为5个等级（表1）。
1.2.3微通道传感器的构建。采用光刻剥离工艺制备两电极微通道传感器，同时考虑微通道结构、通道尺寸、电极形状和尺寸、电极位置、电极材料、管體材料、奶样进样口布局等方面，将设计好的图纸由博奥公司进行加工。微通道传感器的实物如图1、2所示。
1.2.4多频奶样容抗值的测量。
因为温度对牛奶的容抗值影响较大，故在进行试验测试时将奶样测试温度固定在25 ℃左右。将配制好的奶样注入到半圆柱形电极面积为60 μm×60 μm，长3 mm、宽和深均为100 μm的两电极微通道传感器中。最后用电化学工作站完成多频奶样容抗值的测量。每个奶样测试完毕后，所用注射器和传感器都必须用蒸馏水冲洗干净，并用下一个待测奶样冲洗3次。所有的奶样均在采集后的12 h内测试完毕。
2结果与分析
2.1多频奶样容抗值通过在微通道传感器的两电极上加测试电信号，使用电化学工作站的测得的不同细胞含量奶样的多频容抗谱（图3）。不同细胞含量的容抗谱自上而下排列，测试奶样的细胞含量分别为640万、320万、160万、80万、40万个/mL的奶样。由此可知，不同细胞含量奶样的容抗谱排列整齐、区分明显，初步判定传感器的细胞数检测下限可达40万个/mL。 2.2容抗谱分析由图3的容抗谱可知，随着测试频率的增加，容抗会迅速地减小然后基本保持在一个基本恒定的值上，说明在1 000 Hz以上频率段，牛奶电容形成的容抗对总阻抗的影响很小，在这些频率段电阻是总阻抗的主要贡献者。而在10～1 000 Hz，牛奶电容形成的容抗对总阻抗的影响较大，说明低频电容是总阻抗的主要贡献者。因此，确定容抗谱测试不同细胞奶样的有效测试频率范围。
两电极微通道传感器的通道宽度和高度只有100 μm，通道宽度与管道长度、通道高度与管道长度的比值均只有1∶30。因此，在进行奶样细胞测试试验时，可以近似认为奶样中的细胞在传感器的微通道内整体呈现串联排列形式，从而使得细胞含量越高的奶样样本的电容值越小，即容抗值较大，所以奶样细胞含量高的测试样本分布在其他容抗谱的上部。
2.3微通道传感器等效电路模型
斯特恩界面双电层模型是针对电极/溶液界面处形成的双电层结构电容而言的，是一种经典的电极/溶液界面模型[8]。该研究将斯特恩模型应用于两电极测试试验体系，并结合两电极微通道传感器的实际物理结构，考虑溶液电阻（奶体电阻）和界面电阻对整个电化学测试体系的作用，经合理等效简化后得到如图4所示的等效电路图。其中，Ri为界面电阻（传感器测试电极与奶体界面之间形成的电阻），Ci为界面电容（传感器测试电极与奶体界面之间形成的电容），Rm为奶体电阻（奶体本身形成的电阻），Cm为奶体电容（奶体中的细胞所形成的电容）。
2.4等效电路模型结果分析
根据等效电路模型求得的不同细胞含量奶样的奶体电容值与细胞含量之间的线性关系如图5所示。结果表明，不同细胞含量的奶体电容值与奶样细胞含量之间的线性相关性只有R=0.72，绝对系数R2=0.52。这说明奶体电容值可以在一定程度上反映不同细胞含量的奶样，但其相关性并不显著；决定系数R2也偏低，表明奶体电容值并未很好地反映奶样细胞数的变化。产生这种结果的原因是两电极微通道传感器在检测牛奶细胞数方面还存在进一步改进的空间，如进一步减小界面电容对奶体电容造成的测试干扰。
3结论与讨论
通过构建两电极微通道传感器，使用电化学工作站在10～1×106Hz频率对不同细胞含量的奶样进行测试试验。从测得的10～1 000 Hz频率段奶样容抗值可以初步确定具有该结构参数的传感器细胞数检测下限可达40万个/mL；又分析了传感器的等效电路结构，提取出不同细胞含量奶样的奶体电容值，进一步分析奶体电容值与细胞含量之间的线性关系，发现两者之间具有一定的线性相关性，确定奶体电容值可以作为细胞含量检测的一个重要指标。最后提出两电极微通道传感器的结构还有待进一步的优化，例如，如何减小界面电容对奶体电容造成的干扰、如何设计更加合理的等效电路模型来准确提取奶体电容值等，以此来提高传感器的牛奶细胞数检测下限和奶体电容值作为细胞含量检测指标的准确度。
参考文献
[1]
DOS REIS C B M，BARREIRO J R，MORENO J F G，et al.Evaluation of somatic cell count thresholds to detect subclinical mastitis in Gyr cows[J].J Dairy Sci，2011，94（4）：4406-4412.
[2] 崔传金，陈至坤，张学超，等.基于体细胞数的奶牛乳腺炎检测方法研究进展[J].中国乳品工业，2013，41（7）：44-47.
[3] SENGUPTA S，BATTIGELLI D A，CHANG H C.A microscale multifrequency reactance measurement technique to detect bacterial growth at low bioparticle concentrations[J].Lab on a Chip，2006（5）：682-692.
[4] CLAES J E，VAN LMPE J F.Online estimation of the specific growth rate based on viable biomass measurements：Experimental validation[J].Bioproc Eng，1999，21（5）：389-395.
[5] 崔傳金，古少鹏，左月明.基于电参数与神经网络的奶牛乳腺炎检测方法[J].农业机械学报，2011，42（1）：193-197.
[6] SIERRA D，SANCHEZ A，LUENGO C，et al.Temperature effects on fossomatic cell counts in goat milk[J].Int Dairy J，2006，16（4）：385-387.
[7] 刘峰，迟玉杰.乳房炎乳的检测方法[J].现代食品科技，2005，21（1）：129-131.
[8] 李荻.电化学原理[M].3版.北京：北京航空航天大学出版社，2008.
关键词微通道传感器；电容；细胞检测；牛奶
中图分类号S854.4+3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0010-02
AbstractBased on randomly collected fresh milk and cultured K562 cell，some milk samples with different cell contents were prepared，and tested by multifrequency capacitance testing technology within 10-1 000 Hz.Results showed as followed：the determination low limit of milk cell number of microchannel sensor could reach 200 thousand individuals per milliliter；the cell volume capacitance had certain linear relationship with cell content，so the cell volume capacitance could be as an important index for determining cell content.
Key wordsMicrochannel sensor；Capacitance；Cell determination；Milk
牛奶体细胞数是评价奶牛乳腺炎患病等级的重要标准之一，是预测新鲜牛奶产量和质量的重要量化指标[1]。因此，准确、快速地检测新鲜牛奶中的体细胞数非常重要。然而，在体细胞数的所有检测方法中，电检测法被公认为是同时具有检测成本低、快速准确、操作简单等众多优点的检测方法[2]。因此，研发具有检测准确、使用便捷、样品消耗少、能实现在线检测的微通道传感器有着很好的市场前景。
细胞具有完整的膜结构，当其被置于外电场中时，细胞膜内的自由离子在受到电场力的作用下会在细胞膜表面堆积，从而使细胞表现出微小的电容效应[3-4]。崔传金等[5]研究表明，乳汁的电容作为预测乳腺炎的新型参数是完全可行的。鉴于此，笔者采用微流控技术构建两电极微通道传感器，测取了不同细胞含量奶样的电容值，以达到诊断奶牛乳腺炎疾病的目的。
1材料与方法
1.1仪器美国GAMRY REFERENCE 600电化学工作站；美国HERA CELL 150i二氧化碳培养箱；日本OLYMPUS CKX301倒置显微镜；79-1磁力加热搅拌器（北京科伟永兴仪器有限公司）；DC-0515低温恒温槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BCD-219SKDE冷藏柜等。
1.2测试试验
1.2.1奶样采集。
奶样采自正常生理期内的同一头黑白花奶牛。采样时先用温开水擦拭乳头，然后用75%乙醇对乳头进行消毒，并用干净的医用棉签擦干，且弃去前2次挤出的牛奶，再进行奶样采集。每个乳区的牛奶分别挤入50 mL干净的带有编号的玻璃瓶内密封，在运输的过程中放入装有冰袋的隔热泡沫塑料盒内进行保鲜。最后将当天采集的奶样带回实验室测试，无法立刻测试的奶样需在4 ℃条件下冷藏保存，防止牛奶变质而影响测试效果。
1.2.2测试奶样的配制。
将采集回来的奶样放入低温恒温槽中，在40 ℃恒温条件下恒温15 min后取出[6]，用磁力加热搅拌器搅拌3 min，将奶样置入5 μm干净砂芯中进行负压过滤，去除新鲜牛奶中的杂质和原有体细胞，得到无细胞含量的奶样。
试验所需的体细胞用培养后的K562细胞进行替代[3]。将培养好的K562细胞与过滤后的无细胞奶样分别配制为40万、80万、160万、320万、640万个/mL的待测奶样，并进行碘酊染液染色、细胞计数板计数。测试时，同一奶样重复镜检计数3次，取其平均值作为最终细胞值含量。并根据加利福尼亚CMT标准[7]，将奶样划分为5个等级（表1）。
1.2.3微通道传感器的构建。采用光刻剥离工艺制备两电极微通道传感器，同时考虑微通道结构、通道尺寸、电极形状和尺寸、电极位置、电极材料、管體材料、奶样进样口布局等方面，将设计好的图纸由博奥公司进行加工。微通道传感器的实物如图1、2所示。
1.2.4多频奶样容抗值的测量。
因为温度对牛奶的容抗值影响较大，故在进行试验测试时将奶样测试温度固定在25 ℃左右。将配制好的奶样注入到半圆柱形电极面积为60 μm×60 μm，长3 mm、宽和深均为100 μm的两电极微通道传感器中。最后用电化学工作站完成多频奶样容抗值的测量。每个奶样测试完毕后，所用注射器和传感器都必须用蒸馏水冲洗干净，并用下一个待测奶样冲洗3次。所有的奶样均在采集后的12 h内测试完毕。
2结果与分析
2.1多频奶样容抗值通过在微通道传感器的两电极上加测试电信号，使用电化学工作站的测得的不同细胞含量奶样的多频容抗谱（图3）。不同细胞含量的容抗谱自上而下排列，测试奶样的细胞含量分别为640万、320万、160万、80万、40万个/mL的奶样。由此可知，不同细胞含量奶样的容抗谱排列整齐、区分明显，初步判定传感器的细胞数检测下限可达40万个/mL。 2.2容抗谱分析由图3的容抗谱可知，随着测试频率的增加，容抗会迅速地减小然后基本保持在一个基本恒定的值上，说明在1 000 Hz以上频率段，牛奶电容形成的容抗对总阻抗的影响很小，在这些频率段电阻是总阻抗的主要贡献者。而在10～1 000 Hz，牛奶电容形成的容抗对总阻抗的影响较大，说明低频电容是总阻抗的主要贡献者。因此，确定容抗谱测试不同细胞奶样的有效测试频率范围。
两电极微通道传感器的通道宽度和高度只有100 μm，通道宽度与管道长度、通道高度与管道长度的比值均只有1∶30。因此，在进行奶样细胞测试试验时，可以近似认为奶样中的细胞在传感器的微通道内整体呈现串联排列形式，从而使得细胞含量越高的奶样样本的电容值越小，即容抗值较大，所以奶样细胞含量高的测试样本分布在其他容抗谱的上部。
2.3微通道传感器等效电路模型
斯特恩界面双电层模型是针对电极/溶液界面处形成的双电层结构电容而言的，是一种经典的电极/溶液界面模型[8]。该研究将斯特恩模型应用于两电极测试试验体系，并结合两电极微通道传感器的实际物理结构，考虑溶液电阻（奶体电阻）和界面电阻对整个电化学测试体系的作用，经合理等效简化后得到如图4所示的等效电路图。其中，Ri为界面电阻（传感器测试电极与奶体界面之间形成的电阻），Ci为界面电容（传感器测试电极与奶体界面之间形成的电容），Rm为奶体电阻（奶体本身形成的电阻），Cm为奶体电容（奶体中的细胞所形成的电容）。
2.4等效电路模型结果分析
根据等效电路模型求得的不同细胞含量奶样的奶体电容值与细胞含量之间的线性关系如图5所示。结果表明，不同细胞含量的奶体电容值与奶样细胞含量之间的线性相关性只有R=0.72，绝对系数R2=0.52。这说明奶体电容值可以在一定程度上反映不同细胞含量的奶样，但其相关性并不显著；决定系数R2也偏低，表明奶体电容值并未很好地反映奶样细胞数的变化。产生这种结果的原因是两电极微通道传感器在检测牛奶细胞数方面还存在进一步改进的空间，如进一步减小界面电容对奶体电容造成的测试干扰。
3结论与讨论
通过构建两电极微通道传感器，使用电化学工作站在10～1×106Hz频率对不同细胞含量的奶样进行测试试验。从测得的10～1 000 Hz频率段奶样容抗值可以初步确定具有该结构参数的传感器细胞数检测下限可达40万个/mL；又分析了传感器的等效电路结构，提取出不同细胞含量奶样的奶体电容值，进一步分析奶体电容值与细胞含量之间的线性关系，发现两者之间具有一定的线性相关性，确定奶体电容值可以作为细胞含量检测的一个重要指标。最后提出两电极微通道传感器的结构还有待进一步的优化，例如，如何减小界面电容对奶体电容造成的干扰、如何设计更加合理的等效电路模型来准确提取奶体电容值等，以此来提高传感器的牛奶细胞数检测下限和奶体电容值作为细胞含量检测指标的准确度。
参考文献
[1]
DOS REIS C B M，BARREIRO J R，MORENO J F G，et al.Evaluation of somatic cell count thresholds to detect subclinical mastitis in Gyr cows[J].J Dairy Sci，2011，94（4）：4406-4412.
[2] 崔传金，陈至坤，张学超，等.基于体细胞数的奶牛乳腺炎检测方法研究进展[J].中国乳品工业，2013，41（7）：44-47.
[3] SENGUPTA S，BATTIGELLI D A，CHANG H C.A microscale multifrequency reactance measurement technique to detect bacterial growth at low bioparticle concentrations[J].Lab on a Chip，2006（5）：682-692.
[4] CLAES J E，VAN LMPE J F.Online estimation of the specific growth rate based on viable biomass measurements：Experimental validation[J].Bioproc Eng，1999，21（5）：389-395.
[5] 崔傳金，古少鹏，左月明.基于电参数与神经网络的奶牛乳腺炎检测方法[J].农业机械学报，2011，42（1）：193-197.
[6] SIERRA D，SANCHEZ A，LUENGO C，et al.Temperature effects on fossomatic cell counts in goat milk[J].Int Dairy J，2006，16（4）：385-387.
[7] 刘峰，迟玉杰.乳房炎乳的检测方法[J].现代食品科技，2005，21（1）：129-131.
[8] 李荻.电化学原理[M].3版.北京：北京航空航天大学出版社，2008.