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摘要：【目的】明確生防菌爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的防控效果与安全性，为高效绿色防控斜纹夜蛾提供科学依据。【方法】采用浸叶法测定爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内毒力;采用喷雾法测定200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对斜纹夜蛾的田间控制效果;通过药膜法和喷雾法分别评价200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂和甘蓝的安全性。【结果】室内毒力测定结果表明，爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较强的毒杀作用，幼虫取食经1.00×107孢子/mL爪哇棒束孢处理的甘蓝叶片48 h后死亡率达86.96%。田间防治效果试验结果表明，甘蓝田喷施900、1125和1350 g/ha浓度的200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂10 d后对斜纹夜蛾的防治效果分别为73.08%、82.77%和83.69%。安全性评价结果表明，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂48 h的致死中浓度（LC50）为2.11×108孢子/mL，对黑卵蜂安全系数为5.27（t>5.00），为低风险性生物农药;200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对供试3种甘蓝品种生长速率抑制率均在10.00%以下，且无变色、坏死、萎蔫及畸形等任何可见药害症状。【结论】爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较强的毒杀作用，可作为防治斜纹夜蛾有效且安全的生物农药使用。建议在甘蓝斜纹夜蛾低龄幼虫盛发期使用200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂1125～1350 g/ha进行防治。
关键词： 爪哇棒束孢;斜纹夜蛾;室内毒力;防治效果;安全性评价
中图分类号： S433.4;S476.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0995-07
Control effects of biocontrol strain Isaria javanica on Spodoptera litura（Fabricius） and evaluation safety
SU Xiang-ning1， LIU Wei-ling1， WANG Meng2， LIANG Xiao-yu2，HUANG Shao-hua1， LIAO Zhang-xuan1， LI Chuan-ying1， ZHANG Yu-ping1*
（1Plant Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou 510640， China; 2College of Plant
Protection， Hainan University， Haikou 570228， China）
Abstract：【Objective】To evaluate the effects of prevention and control on Spodoptera litura（Fabricius）and the safety of Isaria javanica biocontrol strain and to provide scientific basis for its extensive application. 【Method】The indoor toxi-city of I. javanica to S. litura was tested with leaf immersion method. Field control effects of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP to S. litura were carried out using the spray method. To evaluate the safety of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP on Telenomus remus and Brassica oleracea var. capitata L. were carried out using the drug film method and the spray method， respectively. 【Result】The results showed that I. javanica had a strong toxicity to the 3rd instar larvae of S. litura. The mortality rate of larvae fed on B. oleracea leaves treated with 1.00×107 conidia/mL I. javanica for 48 h reached 86.96%. The results of control effects showed that after spraying 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP at 900，1125 and 1350 g/ha concentrations for 10 d， the control effects on S. litura were 73.08%， 82.77% and 83.69%， respectively. The results of safety evaluation showed that the medial lethal concentration（LC50） of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP for T. remus was 2.11×108 conidia/mL（48 h）. The safety coefficient to T. remus was 5.27（t>5）， which was a low risk biological pesticide. The inhibition rate of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP on the growth rate of the three cabbage varieties was less than 10.00%， and there were no visible symptoms of discoloration， necrosis，wilting，deformity，etc. 【Conclusion】I. javanica has strong toxic effect on 3rd instar larvea of S. litura， can be used as an effective and safe biological pesticide for the control of S. litura. It is suggested that 1125-1350 g/ha 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP can be used at occurrence period of S. litura larvea on cabbage to control the damage. Key words： Isaria javanica; Spodoptera litura（Fabricius）; indoor toxicity; control effects; safety evaluation
Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD0300104）; Applied Scien-ce and Technology Research and Development Project of Guangdong（2016B020234005）; Key-Area Research and Development Project of Guangdong（2020B020223004）; Modern Agricultural Industrial and Technology System Innovation Team Project of Guangdong（2019KJ113）
0 引言
【研究意义】斜纹夜蛾[Spodoptera litura（Fabricius）]隶属鳞翅目（Lepidopetera）夜蛾科（Noctuidae），是一种分布于热带和亚热带地区的世界性害虫，在我国各地均有分布，其寄生范围极广，已知寄主植物有99科290多种，是十字花科蔬菜的重要害虫（Ahmad et al.，2013;丛胜波等，2020）。斜纹夜蛾在我国蔬菜主产区常年均有发生为害，具有间歇暴发成灾的特性，可在短时间内对农作物造成重大损失，严重影响我国蔬菜产业的持续健康发展。目前斜纹夜蛾的防治主要依赖化学农药，但斜纹夜蛾对多种化学农药已产生不同程度的抗性，甚至对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）也产生了抗性，如何高效绿色地防控斜纹夜蛾成为植保领域关注的热点（Kranthi et al.，2002;许忠顺等，2020）。虫生真菌具有易分离培养、能持续控制害虫、对环境友好及不易引起抗性等优点，在害虫生物防治中发挥着重要作用。其中，爪哇棒束孢（Isaria javanica）是一种重要的虫生真菌，其作用机理是通过分生孢子接触虫体后，适宜条件下进入昆虫体内并大量繁殖，破坏昆虫组织器官，同时分泌毒素或次生代谢物，影响昆虫血液，干扰其新陈代谢，从而杀死昆虫（Shah and Pell，2003）。因此，进一步研究爪哇棒束孢对害虫的防控效果与生态安全性，对高效绿色防控害虫具有重要意义。【前人研究進展】目前，已有较多爪哇棒束孢对害虫致病力的研究报道，且主要集中于室内毒力测定方面。Muhammad（2018）在田间分离了2株爪哇棒束孢菌株，采用菌株接种方法表明，2株爪哇棒束孢菌株对在柑橘黄龙病病株上的亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）若虫和成虫具有一定的致病死亡效果。胡琼波等（2020）筛选出1株对黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata）活性较高的爪哇棒束孢IJH6102菌株，通过生物测定的方法表明，在处理14 d后IJH6102对黄曲条跳甲成虫和幼虫的致死率较高，致死中浓度（LC50）分别为8.2×106和6.8×106分生孢子/mL。Wang等（2020）从死亡的美国白蛾（Hyphantria cunea）幼虫虫体表面分离和鉴定爪哇棒束孢BE01，采用室内生物测定方法表明，1 mL 1×104～1×108的BE01孢子悬浮液对3、4和5龄美国白蛾幼虫的致死率均有显著影响。Zhao等（2020）采用室内生物测定方法表明，爪哇棒束孢对水稻害虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）若虫的致死率较高，影响其存活率和繁殖力，同时也降低了成虫的存活率和繁殖力。随着对爪哇棒束孢防治害虫研究的深入，人们开始研究其田间防效。邓嘉茹等（2019）从被侵染的埃及吹绵蚧（Icerya aegyptiaca）虫体表面分离和鉴定获得爪哇棒束孢IJID003，采用室内生物测定和室外喷雾侵染的方法表明，1 mL 1×106～1×108的IJID003孢子悬浮液对埃及吹绵蚧若虫和雌成虫有较强的致病力。张志春等（2020）采用室内生物测定和田间防效试验的方法发现，爪哇棒束孢含量为1 mL 1×106孢子以上对非洲菊烟粉虱（Bemisia tabaci）成虫即具有很高的致病力，3 d后校正死亡率达90%以上，7 d后非洲菊烟粉虱成虫全部死亡。【本研究切入点】前人研究多集中在爪哇棒束孢对一些害虫的致病力方面，而关于爪哇棒束孢及其制剂对斜纹夜蛾的毒力、田间防效，以及制剂对作物和田间天敌的影响鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用室内生物试验测定爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内毒力，通过田间药剂喷雾方法探讨爪哇棒束孢可湿性粉剂在防治斜纹夜蛾中的最佳使用剂量和防治效果，并评价爪哇棒束孢可湿性粉剂对天敌和甘蓝的安全性，为高效绿色防控斜纹夜蛾提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试药剂 1000亿孢子/克爪哇棒束孢母药（保藏号CCTCC NO： M20817，菌株代号Ij0l）和200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂，由广东大丰植保科技有限公司提供;95%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药，黑龙江省大庆志飞生物化工有限公司产品;60亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒原药和10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂，由广州市中达生物工程有限公司提供。
1. 1. 2 供试作物 供试甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）品种：润夏甘蓝、农场主紫甘蓝和富兰克林抱子甘蓝，种子购自广东省农业科学院蔬菜研究所。选取生长大小一致的甘蓝健壮苗移栽于花盆中，在室内培养，培养温度（25±1）℃、湿度（60%～85%）、光周期L∶D=12 h∶12 h，水肥条件良好，试验过程中未施用其他农药。 1. 1. 3 供试昆虫 斜纹夜蛾室内种群由武汉楚强生物科技有限公司提供，在室内未接触任何药剂人工饲养多年，对多种杀虫剂敏感。试验前用新鲜、未施药的甘蓝叶片饲养初孵幼虫至3龄，选取发育整齐的3龄幼虫，使之饱食后禁食4 h供试。斜纹夜蛾天敌黑卵蜂（Telenomus remus）采集于广东省广州市钟落潭蔬菜地，采集后于实验室内饲养，用斜纹夜蛾卵块繁殖。以上供试昆虫置于温度（25±1）℃、湿度（70±10）%、光周期L∶D=14 h∶10 h的光照培養箱中饲养。
1. 1. 4 主要仪器 人工气候箱（宁波江南仪器RXZ-160）、电子分析天平（赛多利斯BSA124S）和背负式电动喷雾器（M9W-315207）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 爪哇棒束孢室内生物测定 采用浸叶法测定爪哇棒束孢对斜纹夜蛾幼虫的杀虫活性（蒋兴川等，2019）。用清水将1000亿孢子/克爪哇棒束孢母药稀释成1.00×107、2.50×106、6.25×105、1.56×105和3.91×104孢子/mL共5个浓度;将甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药用少量丙酮溶解，再用0.1%吐温水溶液稀释成0.2500000、0.0625000、0.0312500、0.0156250和0.0078125 mg/L共5个浓度作为化学药剂对照;用清水将60亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒原药稀释成1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104和1.00×103 PIB/mL共5个浓度作为生物药剂对照;另设清水对照。随后用口径与12孔细胞培养板内径相同的打孔器将备用甘蓝叶打成圆片后浸于待测药剂溶液中，20 s后取出晾干置于12孔细胞培养板，每孔2片叶，每孔接入1头斜纹夜蛾3龄幼虫。每处理4个重复。处理后48 h分别检查试验组与对照组幼虫存活情况，以毛刷轻触幼虫体表，5 s内幼虫躯体和附足不动即视为死亡，对照组死亡率小于10%视为有效试验。记录斜纹夜蛾幼虫死亡数和存活数，根据试验结果，计算毒力回归方程、LC50及95%置信区间、相关系数和校正死亡率。相关计算公式如下：
死亡率（%）=（死亡虫数/供试虫数）×100
校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/
（1-对照死亡率）×100
1. 2. 2 田间药效试验 试验在中国农业大学上庄试验站北区进行，供试甘蓝品种为润夏甘蓝，试验时甘蓝长势均匀，试验地土质为中性土壤，所有试验小区栽培条件（水肥管理、移栽期、种植密度、生育期、水层管理）均匀一致，且符合当地科学的农业实践。试验时田间斜纹夜蛾以2～3龄幼虫为主。200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂设900、1125和1350 g/ha 3个处理，以10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂1125 g/ha为药剂对照，清水为空白对照（CK）。每处理4个重复，共20个小区，每小区面积20 m2，完全随机排列，小区间设1 m宽的保护行。采用喷雾法，药剂兑水喷雾，每公顷施药液量750 L。调查采用五点取样，每点调查10棵甘蓝上斜纹夜蛾幼虫数。分别于药前调查虫口基数，药后3、7和10 d调查残余活虫数，根据药后的虫口减退率计算防治效果。计算公式如下：
虫口减退率（%）=（处理前虫口数量-处理后虫
口数量）/处理前虫口数量×100
防治效果（%）=（处理区虫口减退率-对照区虫
口减退率）/（100-对照区虫口减
退率）×100
1. 2. 3 爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的安全性评价 采用药膜法测定供试药剂对黑卵蜂成蜂的毒力。用清水将200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂稀释成有效浓度为6.40×108、1.60×108、4.00×107、1.00×107和2.50×106孢子/mL共5个浓度，用滴管吸取药液滴入玻璃试管中，摇晃均匀后倒出多余的药液，待药液充分形成药膜后，挑选同一天羽化且健康的黑卵蜂成虫10头放入试管中，每处理5个重复;清水为空白对照。用少量5%蜂蜜水润湿脱脂棉封口，置于温度（25±1）℃、湿度（70±10）%、光周期L∶D=14 h∶10 h的光照培养箱中饲养。于48 h后统计黑卵蜂成虫的死亡数，以日光照射下轻敲试管，黑卵蜂不动记为死亡。计算公式如下：
安全系数（t）=天敌的LC50/田间推荐使用有效
浓度
根据《化学农药环境安全评价试验准则》，t>5.00为低风险性生物农药;0.50<t≤5.00为中等风险性生物农药;0.05<t≤0.50为高风险性生物农药;t≤0.05为极高风险性生物农药。
1. 2. 4 爪哇棒束孢可湿性粉剂对甘蓝的室内安全性评价 供试甘蓝品种为润夏甘蓝、农场主紫甘蓝和富兰克林抱子甘蓝，试验时甘蓝长势均匀。200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂设1350、2700和5400 g/ha（有效成分）3个处理，使用背负式喷雾器（压力45 Pa，喷雾速度0.45 L/min）均匀喷施于甘蓝叶片的正反面，并设清水对照。每处理4个重复，每重复20株甘蓝。试验过程中未施用其他农药。分别于喷药前和喷药后3、7、14和21 d调查各处理甘蓝株高（茎长）、生长速率、植株形态和叶色变化。处理21 d内作物未见任何药害症状为很安全;生长抑制率在10.00%以内为安全，11.00%～20.00%为轻微药害，21.00%～50.00%为中度药害，50.00%以上为严重药害。计算公式如下：
生长速率抑制率（%）=（空白对照植株新生高
度-药剂处理植株新生高
度）/空白对照植株新生高
度×100
1. 3 统计分析
试验数据采用Excel 2010进行统计和整理，计算各试验处理浓度下48 h斜纹夜蛾幼虫的死亡率、虫口减退率、校正死率和生长速率抑制率，计算毒力回归方程和LC50及其95%置信区间;采用SPSS 20.0中的邓肯氏新复极差法对校正死亡率数据进行差异显著性分析。 2 结果与分析
2. 1 爪哇棒束孢对斜纹夜蛾幼虫的杀虫活性
由表1可知，不同浓度爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率存在显著差异（P<0.05，下同），随着浓度的降低幼虫的校正死亡率显著下降。斜纹夜蛾3龄幼虫取食经1.00×107孢子/mL爪哇棒束孢处理的甘蓝叶片48 h后死亡率达86.96%，显著高于其他处理，经计算得到爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内毒力回归方程為y=0.9132x-0.3147，48 h的LC50为6.60×105孢子/mL，95%置信区间为4.24×105～1.03×106孢子/mL，相关系数为0.9892;斜纹夜蛾3龄幼虫取食经1.00×107 PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒处理的甘蓝叶片48 h后死亡率为76.67%，经计算得到斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾的室内毒力回归方程为y=0.5070x-2.8344，48 h的LC50为3.89×105 PIB/mL，95%置信区间为1.42×105～1.34×106 PIB/mL，相关系数为0.9165;斜纹夜蛾3龄幼虫取食经0.2500000 mg/L甲氨基阿维菌素苯甲酸盐处理的甘蓝叶片48 h后校正死亡率为78.26%，经计算得到甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对甘蓝斜纹夜蛾的室内毒力回归方程为y=1.3642x+6.6437，48 h的LC50为0.0624 mg/L，95%置信区间为0.0461～0.0845 mg/L，相关系数为0.9801。结果表明爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较高的杀虫活性。
2. 2 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对斜纹夜蛾的田间防治效果
不同处理对斜纹蛾的田间防治效果试验结果（表2）表明，4个药剂处理对斜纹夜蛾的速效性较差，药后3 d，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂3个浓度处理及10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂处理对斜纹夜蛾的防治效果均在60.00%左右，不同处理间防效差异不显著（P>0.05，下同）;药后7 d，4个药剂处理对斜纹夜蛾的防治效果较药后3 d均有大幅提升，其中以200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂1350 g/ha处理的防治效果最高，达85.81%，以200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂900 g/ha处理的防治效果最低，为74.15%，显著低于其他3个处理，而其他3个处理间差异不显著;药后10 d，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂900、1125和1350 g/ha处理及10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂1125 g/ha处理对斜纹夜蛾的防治效果较稳定，分别为73.08%、82.77%、83.69%和84.34%，与药后7 d的防治效果相近。
2. 3 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的安全性评价
由表3可知，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的室内毒力回归方程为y=0.8893x-7.4026，48 h的LC50为2.11×108孢子/mL，95%置信区间为6.22×107～4.82×109孢子/mL。根据田间推荐使用有效浓度计算得安全系数为5.27（t>5.00）。因此，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂为低风险性生物农药，在田间使用对天敌黑卵蜂较安全。
2. 4 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对3种甘蓝的安全性评价
由图1可知，施用1350、2700和5400 g/ha的200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂后，3种甘蓝品种的生长速率抑制率均在10.00%以下，且无变色、坏死、萎蔫和畸形等任何可见药害症状。其中，施用5400 g/ha的200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂3 d后，富兰克林抱子甘蓝的生长速率抑制率最高，为5.63%，但施药7、14和21 d后，其生长速率抑制率分别降至3.23%、3.49%和3.99%。表明200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对常见类型甘蓝均安全。
3 讨论
农药在农业生产中具有重要作用。随着现代社会人类对环境保护和生态安全意识的提高，人们认识到大量使用合成农药会造成难以克服的弊病，如3R问题等（王永强等，2019）。生物农药由于其不可比拟的优越性而日益受到人们的重视和青睐。虫生真菌作为重要的生物农药种类，具有活性高、选择性强、对人畜安全、对生态环境友好、易于规模生产、害虫难以产生抗性等优点。由于长期使用化学农药，斜纹夜蛾对一些常用化学药剂及多种作用机制独特的新型药剂产生了不同程度的抗性，利用生物农药可很好地解决这些问题（桑松等，2013）。国内外已有昆虫病原真菌爪哇棒束孢在自然条件下感染鳞翅目昆虫的报道（黄渤等，2008;Specht et al.，2009; Shimazu and Takatsuka，2010），但关于爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内活性以及田间条件下对斜纹夜蛾的防治效果评价未见报道。
甲维盐是1984年美国Merk & Co.公司合成的一种新型高效抗生素类杀虫、杀螨剂，是目前已知杀虫剂中对鳞翅目昆虫杀虫活性最高的杀虫剂（Mrozik，1984）。核型多角体病毒是斜纹夜蛾的主要病原微生物，室内对斜纹夜蛾具有较强的毒力（邹金城等，2016）。本研究利用甲维盐和核型多角体病毒作为室内活性测定的对照药剂，结果发现，爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫的杀虫活性高于2种对照药剂，可进一步评价其田间防治效果。斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾种群具有良好的控制作用，是有效防治斜纹夜蛾的生物制剂（邹金城等，2016）。本研究利用10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂作为田间防效的对照药剂，发现200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对斜纹夜蛾也具有很好的田间防治效果，其中、高剂量（有效成分用量1125和1350 g/ha）处理对斜纹夜蛾幼虫的防治效果与10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂的防治效果相当，二者间无显著差异，对斜纹夜蛾的防治潜力较大。 广谱类化学杀虫剂在防治害虫的同时也可能杀死天敌生物并破坏生态平衡。有研究报道，甲维盐虽然对鳞翅目害虫具有较高毒力，但对天敌昆虫松毛虫赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi Matsumura）也具有很高毒力，对赤眼蜂科昆虫成虫存活和繁殖具有显著影响（Hussain et al.，2010; Sattar et al.，2011）。某些化学农药还会对天敌的寄生率、寿命、搜寻和寄生能力等产生负面影响（陈德锟，2014; 田俊策等，2017）。本研究发现，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂安全系数较高，为低风险性生物农药。然而，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂田间施用浓度下是否会对天敌的生长发育、寿命及对寄主搜寻与寄生能力产生影响还有待进一步探究。基于本研究结果，爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的生物防治潜力较大，可替代市面上风险较高的化学农药产品，也可在甘蓝生产上进行组合交替使用。由于杀虫真菌见效较化学农药缓慢，建议在甘蓝斜纹夜蛾低龄幼虫盛发期使用200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂进行防治。
4 结论
爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较强的毒杀作用，可作为防治斜纹夜蛾有效且安全的生物农药使用。建议在甘蓝斜纹夜蛾低龄幼虫盛发期使用200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂进行防治，推荐制剂用量为1125～1350 g/ha。
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（責任编辑 麻小燕）
关键词： 爪哇棒束孢;斜纹夜蛾;室内毒力;防治效果;安全性评价
中图分类号： S433.4;S476.12 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0995-07
Control effects of biocontrol strain Isaria javanica on Spodoptera litura（Fabricius） and evaluation safety
SU Xiang-ning1， LIU Wei-ling1， WANG Meng2， LIANG Xiao-yu2，HUANG Shao-hua1， LIAO Zhang-xuan1， LI Chuan-ying1， ZHANG Yu-ping1*
（1Plant Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou 510640， China; 2College of Plant
Protection， Hainan University， Haikou 570228， China）
Abstract：【Objective】To evaluate the effects of prevention and control on Spodoptera litura（Fabricius）and the safety of Isaria javanica biocontrol strain and to provide scientific basis for its extensive application. 【Method】The indoor toxi-city of I. javanica to S. litura was tested with leaf immersion method. Field control effects of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP to S. litura were carried out using the spray method. To evaluate the safety of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP on Telenomus remus and Brassica oleracea var. capitata L. were carried out using the drug film method and the spray method， respectively. 【Result】The results showed that I. javanica had a strong toxicity to the 3rd instar larvae of S. litura. The mortality rate of larvae fed on B. oleracea leaves treated with 1.00×107 conidia/mL I. javanica for 48 h reached 86.96%. The results of control effects showed that after spraying 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP at 900，1125 and 1350 g/ha concentrations for 10 d， the control effects on S. litura were 73.08%， 82.77% and 83.69%， respectively. The results of safety evaluation showed that the medial lethal concentration（LC50） of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP for T. remus was 2.11×108 conidia/mL（48 h）. The safety coefficient to T. remus was 5.27（t>5）， which was a low risk biological pesticide. The inhibition rate of 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP on the growth rate of the three cabbage varieties was less than 10.00%， and there were no visible symptoms of discoloration， necrosis，wilting，deformity，etc. 【Conclusion】I. javanica has strong toxic effect on 3rd instar larvea of S. litura， can be used as an effective and safe biological pesticide for the control of S. litura. It is suggested that 1125-1350 g/ha 2.0×1010 conidia/mL I. javanica WP can be used at occurrence period of S. litura larvea on cabbage to control the damage. Key words： Isaria javanica; Spodoptera litura（Fabricius）; indoor toxicity; control effects; safety evaluation
Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2019YFD0300104）; Applied Scien-ce and Technology Research and Development Project of Guangdong（2016B020234005）; Key-Area Research and Development Project of Guangdong（2020B020223004）; Modern Agricultural Industrial and Technology System Innovation Team Project of Guangdong（2019KJ113）
0 引言
【研究意义】斜纹夜蛾[Spodoptera litura（Fabricius）]隶属鳞翅目（Lepidopetera）夜蛾科（Noctuidae），是一种分布于热带和亚热带地区的世界性害虫，在我国各地均有分布，其寄生范围极广，已知寄主植物有99科290多种，是十字花科蔬菜的重要害虫（Ahmad et al.，2013;丛胜波等，2020）。斜纹夜蛾在我国蔬菜主产区常年均有发生为害，具有间歇暴发成灾的特性，可在短时间内对农作物造成重大损失，严重影响我国蔬菜产业的持续健康发展。目前斜纹夜蛾的防治主要依赖化学农药，但斜纹夜蛾对多种化学农药已产生不同程度的抗性，甚至对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）也产生了抗性，如何高效绿色地防控斜纹夜蛾成为植保领域关注的热点（Kranthi et al.，2002;许忠顺等，2020）。虫生真菌具有易分离培养、能持续控制害虫、对环境友好及不易引起抗性等优点，在害虫生物防治中发挥着重要作用。其中，爪哇棒束孢（Isaria javanica）是一种重要的虫生真菌，其作用机理是通过分生孢子接触虫体后，适宜条件下进入昆虫体内并大量繁殖，破坏昆虫组织器官，同时分泌毒素或次生代谢物，影响昆虫血液，干扰其新陈代谢，从而杀死昆虫（Shah and Pell，2003）。因此，进一步研究爪哇棒束孢对害虫的防控效果与生态安全性，对高效绿色防控害虫具有重要意义。【前人研究進展】目前，已有较多爪哇棒束孢对害虫致病力的研究报道，且主要集中于室内毒力测定方面。Muhammad（2018）在田间分离了2株爪哇棒束孢菌株，采用菌株接种方法表明，2株爪哇棒束孢菌株对在柑橘黄龙病病株上的亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）若虫和成虫具有一定的致病死亡效果。胡琼波等（2020）筛选出1株对黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata）活性较高的爪哇棒束孢IJH6102菌株，通过生物测定的方法表明，在处理14 d后IJH6102对黄曲条跳甲成虫和幼虫的致死率较高，致死中浓度（LC50）分别为8.2×106和6.8×106分生孢子/mL。Wang等（2020）从死亡的美国白蛾（Hyphantria cunea）幼虫虫体表面分离和鉴定爪哇棒束孢BE01，采用室内生物测定方法表明，1 mL 1×104～1×108的BE01孢子悬浮液对3、4和5龄美国白蛾幼虫的致死率均有显著影响。Zhao等（2020）采用室内生物测定方法表明，爪哇棒束孢对水稻害虫褐飞虱（Nilaparvata lugens）若虫的致死率较高，影响其存活率和繁殖力，同时也降低了成虫的存活率和繁殖力。随着对爪哇棒束孢防治害虫研究的深入，人们开始研究其田间防效。邓嘉茹等（2019）从被侵染的埃及吹绵蚧（Icerya aegyptiaca）虫体表面分离和鉴定获得爪哇棒束孢IJID003，采用室内生物测定和室外喷雾侵染的方法表明，1 mL 1×106～1×108的IJID003孢子悬浮液对埃及吹绵蚧若虫和雌成虫有较强的致病力。张志春等（2020）采用室内生物测定和田间防效试验的方法发现，爪哇棒束孢含量为1 mL 1×106孢子以上对非洲菊烟粉虱（Bemisia tabaci）成虫即具有很高的致病力，3 d后校正死亡率达90%以上，7 d后非洲菊烟粉虱成虫全部死亡。【本研究切入点】前人研究多集中在爪哇棒束孢对一些害虫的致病力方面，而关于爪哇棒束孢及其制剂对斜纹夜蛾的毒力、田间防效，以及制剂对作物和田间天敌的影响鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用室内生物试验测定爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内毒力，通过田间药剂喷雾方法探讨爪哇棒束孢可湿性粉剂在防治斜纹夜蛾中的最佳使用剂量和防治效果，并评价爪哇棒束孢可湿性粉剂对天敌和甘蓝的安全性，为高效绿色防控斜纹夜蛾提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试药剂 1000亿孢子/克爪哇棒束孢母药（保藏号CCTCC NO： M20817，菌株代号Ij0l）和200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂，由广东大丰植保科技有限公司提供;95%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药，黑龙江省大庆志飞生物化工有限公司产品;60亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒原药和10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂，由广州市中达生物工程有限公司提供。
1. 1. 2 供试作物 供试甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.）品种：润夏甘蓝、农场主紫甘蓝和富兰克林抱子甘蓝，种子购自广东省农业科学院蔬菜研究所。选取生长大小一致的甘蓝健壮苗移栽于花盆中，在室内培养，培养温度（25±1）℃、湿度（60%～85%）、光周期L∶D=12 h∶12 h，水肥条件良好，试验过程中未施用其他农药。 1. 1. 3 供试昆虫 斜纹夜蛾室内种群由武汉楚强生物科技有限公司提供，在室内未接触任何药剂人工饲养多年，对多种杀虫剂敏感。试验前用新鲜、未施药的甘蓝叶片饲养初孵幼虫至3龄，选取发育整齐的3龄幼虫，使之饱食后禁食4 h供试。斜纹夜蛾天敌黑卵蜂（Telenomus remus）采集于广东省广州市钟落潭蔬菜地，采集后于实验室内饲养，用斜纹夜蛾卵块繁殖。以上供试昆虫置于温度（25±1）℃、湿度（70±10）%、光周期L∶D=14 h∶10 h的光照培養箱中饲养。
1. 1. 4 主要仪器 人工气候箱（宁波江南仪器RXZ-160）、电子分析天平（赛多利斯BSA124S）和背负式电动喷雾器（M9W-315207）。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 爪哇棒束孢室内生物测定 采用浸叶法测定爪哇棒束孢对斜纹夜蛾幼虫的杀虫活性（蒋兴川等，2019）。用清水将1000亿孢子/克爪哇棒束孢母药稀释成1.00×107、2.50×106、6.25×105、1.56×105和3.91×104孢子/mL共5个浓度;将甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药用少量丙酮溶解，再用0.1%吐温水溶液稀释成0.2500000、0.0625000、0.0312500、0.0156250和0.0078125 mg/L共5个浓度作为化学药剂对照;用清水将60亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒原药稀释成1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104和1.00×103 PIB/mL共5个浓度作为生物药剂对照;另设清水对照。随后用口径与12孔细胞培养板内径相同的打孔器将备用甘蓝叶打成圆片后浸于待测药剂溶液中，20 s后取出晾干置于12孔细胞培养板，每孔2片叶，每孔接入1头斜纹夜蛾3龄幼虫。每处理4个重复。处理后48 h分别检查试验组与对照组幼虫存活情况，以毛刷轻触幼虫体表，5 s内幼虫躯体和附足不动即视为死亡，对照组死亡率小于10%视为有效试验。记录斜纹夜蛾幼虫死亡数和存活数，根据试验结果，计算毒力回归方程、LC50及95%置信区间、相关系数和校正死亡率。相关计算公式如下：
死亡率（%）=（死亡虫数/供试虫数）×100
校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/
（1-对照死亡率）×100
1. 2. 2 田间药效试验 试验在中国农业大学上庄试验站北区进行，供试甘蓝品种为润夏甘蓝，试验时甘蓝长势均匀，试验地土质为中性土壤，所有试验小区栽培条件（水肥管理、移栽期、种植密度、生育期、水层管理）均匀一致，且符合当地科学的农业实践。试验时田间斜纹夜蛾以2～3龄幼虫为主。200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂设900、1125和1350 g/ha 3个处理，以10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂1125 g/ha为药剂对照，清水为空白对照（CK）。每处理4个重复，共20个小区，每小区面积20 m2，完全随机排列，小区间设1 m宽的保护行。采用喷雾法，药剂兑水喷雾，每公顷施药液量750 L。调查采用五点取样，每点调查10棵甘蓝上斜纹夜蛾幼虫数。分别于药前调查虫口基数，药后3、7和10 d调查残余活虫数，根据药后的虫口减退率计算防治效果。计算公式如下：
虫口减退率（%）=（处理前虫口数量-处理后虫
口数量）/处理前虫口数量×100
防治效果（%）=（处理区虫口减退率-对照区虫
口减退率）/（100-对照区虫口减
退率）×100
1. 2. 3 爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的安全性评价 采用药膜法测定供试药剂对黑卵蜂成蜂的毒力。用清水将200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂稀释成有效浓度为6.40×108、1.60×108、4.00×107、1.00×107和2.50×106孢子/mL共5个浓度，用滴管吸取药液滴入玻璃试管中，摇晃均匀后倒出多余的药液，待药液充分形成药膜后，挑选同一天羽化且健康的黑卵蜂成虫10头放入试管中，每处理5个重复;清水为空白对照。用少量5%蜂蜜水润湿脱脂棉封口，置于温度（25±1）℃、湿度（70±10）%、光周期L∶D=14 h∶10 h的光照培养箱中饲养。于48 h后统计黑卵蜂成虫的死亡数，以日光照射下轻敲试管，黑卵蜂不动记为死亡。计算公式如下：
安全系数（t）=天敌的LC50/田间推荐使用有效
浓度
根据《化学农药环境安全评价试验准则》，t>5.00为低风险性生物农药;0.50<t≤5.00为中等风险性生物农药;0.05<t≤0.50为高风险性生物农药;t≤0.05为极高风险性生物农药。
1. 2. 4 爪哇棒束孢可湿性粉剂对甘蓝的室内安全性评价 供试甘蓝品种为润夏甘蓝、农场主紫甘蓝和富兰克林抱子甘蓝，试验时甘蓝长势均匀。200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂设1350、2700和5400 g/ha（有效成分）3个处理，使用背负式喷雾器（压力45 Pa，喷雾速度0.45 L/min）均匀喷施于甘蓝叶片的正反面，并设清水对照。每处理4个重复，每重复20株甘蓝。试验过程中未施用其他农药。分别于喷药前和喷药后3、7、14和21 d调查各处理甘蓝株高（茎长）、生长速率、植株形态和叶色变化。处理21 d内作物未见任何药害症状为很安全;生长抑制率在10.00%以内为安全，11.00%～20.00%为轻微药害，21.00%～50.00%为中度药害，50.00%以上为严重药害。计算公式如下：
生长速率抑制率（%）=（空白对照植株新生高
度-药剂处理植株新生高
度）/空白对照植株新生高
度×100
1. 3 统计分析
试验数据采用Excel 2010进行统计和整理，计算各试验处理浓度下48 h斜纹夜蛾幼虫的死亡率、虫口减退率、校正死率和生长速率抑制率，计算毒力回归方程和LC50及其95%置信区间;采用SPSS 20.0中的邓肯氏新复极差法对校正死亡率数据进行差异显著性分析。 2 结果与分析
2. 1 爪哇棒束孢对斜纹夜蛾幼虫的杀虫活性
由表1可知，不同浓度爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫的致死率存在显著差异（P<0.05，下同），随着浓度的降低幼虫的校正死亡率显著下降。斜纹夜蛾3龄幼虫取食经1.00×107孢子/mL爪哇棒束孢处理的甘蓝叶片48 h后死亡率达86.96%，显著高于其他处理，经计算得到爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内毒力回归方程為y=0.9132x-0.3147，48 h的LC50为6.60×105孢子/mL，95%置信区间为4.24×105～1.03×106孢子/mL，相关系数为0.9892;斜纹夜蛾3龄幼虫取食经1.00×107 PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒处理的甘蓝叶片48 h后死亡率为76.67%，经计算得到斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾的室内毒力回归方程为y=0.5070x-2.8344，48 h的LC50为3.89×105 PIB/mL，95%置信区间为1.42×105～1.34×106 PIB/mL，相关系数为0.9165;斜纹夜蛾3龄幼虫取食经0.2500000 mg/L甲氨基阿维菌素苯甲酸盐处理的甘蓝叶片48 h后校正死亡率为78.26%，经计算得到甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对甘蓝斜纹夜蛾的室内毒力回归方程为y=1.3642x+6.6437，48 h的LC50为0.0624 mg/L，95%置信区间为0.0461～0.0845 mg/L，相关系数为0.9801。结果表明爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较高的杀虫活性。
2. 2 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对斜纹夜蛾的田间防治效果
不同处理对斜纹蛾的田间防治效果试验结果（表2）表明，4个药剂处理对斜纹夜蛾的速效性较差，药后3 d，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂3个浓度处理及10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂处理对斜纹夜蛾的防治效果均在60.00%左右，不同处理间防效差异不显著（P>0.05，下同）;药后7 d，4个药剂处理对斜纹夜蛾的防治效果较药后3 d均有大幅提升，其中以200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂1350 g/ha处理的防治效果最高，达85.81%，以200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂900 g/ha处理的防治效果最低，为74.15%，显著低于其他3个处理，而其他3个处理间差异不显著;药后10 d，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂900、1125和1350 g/ha处理及10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂1125 g/ha处理对斜纹夜蛾的防治效果较稳定，分别为73.08%、82.77%、83.69%和84.34%，与药后7 d的防治效果相近。
2. 3 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的安全性评价
由表3可知，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂的室内毒力回归方程为y=0.8893x-7.4026，48 h的LC50为2.11×108孢子/mL，95%置信区间为6.22×107～4.82×109孢子/mL。根据田间推荐使用有效浓度计算得安全系数为5.27（t>5.00）。因此，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂为低风险性生物农药，在田间使用对天敌黑卵蜂较安全。
2. 4 200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对3种甘蓝的安全性评价
由图1可知，施用1350、2700和5400 g/ha的200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂后，3种甘蓝品种的生长速率抑制率均在10.00%以下，且无变色、坏死、萎蔫和畸形等任何可见药害症状。其中，施用5400 g/ha的200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂3 d后，富兰克林抱子甘蓝的生长速率抑制率最高，为5.63%，但施药7、14和21 d后，其生长速率抑制率分别降至3.23%、3.49%和3.99%。表明200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对常见类型甘蓝均安全。
3 讨论
农药在农业生产中具有重要作用。随着现代社会人类对环境保护和生态安全意识的提高，人们认识到大量使用合成农药会造成难以克服的弊病，如3R问题等（王永强等，2019）。生物农药由于其不可比拟的优越性而日益受到人们的重视和青睐。虫生真菌作为重要的生物农药种类，具有活性高、选择性强、对人畜安全、对生态环境友好、易于规模生产、害虫难以产生抗性等优点。由于长期使用化学农药，斜纹夜蛾对一些常用化学药剂及多种作用机制独特的新型药剂产生了不同程度的抗性，利用生物农药可很好地解决这些问题（桑松等，2013）。国内外已有昆虫病原真菌爪哇棒束孢在自然条件下感染鳞翅目昆虫的报道（黄渤等，2008;Specht et al.，2009; Shimazu and Takatsuka，2010），但关于爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的室内活性以及田间条件下对斜纹夜蛾的防治效果评价未见报道。
甲维盐是1984年美国Merk & Co.公司合成的一种新型高效抗生素类杀虫、杀螨剂，是目前已知杀虫剂中对鳞翅目昆虫杀虫活性最高的杀虫剂（Mrozik，1984）。核型多角体病毒是斜纹夜蛾的主要病原微生物，室内对斜纹夜蛾具有较强的毒力（邹金城等，2016）。本研究利用甲维盐和核型多角体病毒作为室内活性测定的对照药剂，结果发现，爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫的杀虫活性高于2种对照药剂，可进一步评价其田间防治效果。斜纹夜蛾核型多角体病毒对斜纹夜蛾种群具有良好的控制作用，是有效防治斜纹夜蛾的生物制剂（邹金城等，2016）。本研究利用10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂作为田间防效的对照药剂，发现200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对斜纹夜蛾也具有很好的田间防治效果，其中、高剂量（有效成分用量1125和1350 g/ha）处理对斜纹夜蛾幼虫的防治效果与10亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒悬浮剂的防治效果相当，二者间无显著差异，对斜纹夜蛾的防治潜力较大。 广谱类化学杀虫剂在防治害虫的同时也可能杀死天敌生物并破坏生态平衡。有研究报道，甲维盐虽然对鳞翅目害虫具有较高毒力，但对天敌昆虫松毛虫赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi Matsumura）也具有很高毒力，对赤眼蜂科昆虫成虫存活和繁殖具有显著影响（Hussain et al.，2010; Sattar et al.，2011）。某些化学农药还会对天敌的寄生率、寿命、搜寻和寄生能力等产生负面影响（陈德锟，2014; 田俊策等，2017）。本研究发现，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂对黑卵蜂安全系数较高，为低风险性生物农药。然而，200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂田间施用浓度下是否会对天敌的生长发育、寿命及对寄主搜寻与寄生能力产生影响还有待进一步探究。基于本研究结果，爪哇棒束孢对斜纹夜蛾的生物防治潜力较大，可替代市面上风险较高的化学农药产品，也可在甘蓝生产上进行组合交替使用。由于杀虫真菌见效较化学农药缓慢，建议在甘蓝斜纹夜蛾低龄幼虫盛发期使用200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂进行防治。
4 结论
爪哇棒束孢对斜纹夜蛾3龄幼虫具有较强的毒杀作用，可作为防治斜纹夜蛾有效且安全的生物农药使用。建议在甘蓝斜纹夜蛾低龄幼虫盛发期使用200亿孢子/克爪哇棒束孢可湿性粉剂进行防治，推荐制剂用量为1125～1350 g/ha。
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（責任编辑 麻小燕）