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摘要：建立了采用高效液相色谱串联质谱仪同时测定麻辣豆制品中非法添加的4种工业染料包括碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的检测分析方法。样品经乙腈提取，中性氧化铝固相萃取柱净化，以乙腈和1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，电喷雾负离子（ESI+）模式电离，超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS/MS）测定。结果表明：4种工业染料的线性范围在5～100μg/L，相关系数r2均优于0.999。在此范围内加标回收率为84.5%～105.6%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～6.8%，碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的检出限分别为1.5μg/kg、0.5μg/kg、0.5μg/kg、0.5μg/kg。该方法前处理简单易操作，分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，可用于麻辣豆制品中上述4 种工业染料的同时测定及确证。
关键词：超高效液相色谱串联质谱 麻辣豆制品 工业染料
中图分类号：TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0039-02
随着国内人们生活水平的提高，人们的饮食越来越趋近于多样化。麻辣豆制品，也在市场中占据了一席之地。某些不法商家为追求利润，在麻辣豆制品中加入碱性橙、碱性嫩黄O等工业染料，从而使其色泽更加鲜亮，但这些工业染料对人体有一定的毒副作用。人们长期食用添加过工业染料的豆制品，会对身体健康带来很大的安全隐患。国家、企业等相关单位对碱性橙2等工业染料检测有相关的报道及方法标准[1-3]，但能同时对3种碱性橙和碱性嫩黄O进行提取以及使用液相色谱质谱定量检测的方法还未见报道。
本研究建立了采用高效液相色谱串联质谱仪同时测定麻辣豆制品中非法添加的4种工业染料包括碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的检测分析方法，优化了提取及净化条件，可为市场上麻辣豆制品的检测提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
标准品购置：碱性橙2（99.9%）；碱性橙21（99.9%）；碱性橙22（99.9%）；碱性嫩黄O（99.8%）；甲醇，乙腈均为色谱纯；甲酸，分析纯；C18柱；中性氧化铝固相萃取柱及0.22μm有机滤膜均购于美瑞泰克科技（天津）有限公司。
液相色谱仪：岛津LC-30系列，日本岛津公司；质谱仪：API 4000配有电喷雾离子源（ESI）及数据处理系统，美国应用生物系统公司；超纯水机：美国Millipore公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
储备液：准确称取碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O标准品各0.1g（精确至 0.001g），用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准品储备液，4℃冰箱保存备用。
工作液：储备液用甲醇逐级稀释，配制成系列工作液。
1.2.2 样品制备
提取；称取均质好的豆制品5g置于100mL烧杯中，加人乙腈10mL，超声提取10min，将提取液用滤纸过滤到圆底烧瓶中，再加人乙腈10mL，重复上述操作3次，合并提取液，转移提取液过中性氧化铝固相萃取柱，用少量乙腈冲洗残渣并过柱，定容至50mL，经0.22μm 微孔滤膜过滤后用于UPLC-MS/MS测定。
1.2.3 色谱、质谱条件
（1）液相色谱条件；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm×3.5μm）；柱温为36℃；进样量为3μL；流动相：1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～5.0min，90%～10%A；5.0～8min，90%A；流速为0.5mL/min。
（2）质谱条件；电喷雾离子源（ESI+）；离子源温度（TEM）为500℃；雾化气（GS1）为60psi；碰撞气（CAD）为 8psi；气帘气（CUR）为24psi；辅助加热器（GS2）为60psi；喷雾电压（IS）为5500V。
2 结果与讨论
2.1 提取与净化条件的优化
2.1.1 提取溶剂的选择
由于4种工业染料均溶于醇、水等多种溶剂，分别以甲醇、乙腈和水三种试剂进行提取。结果表明，以乙腈作为提取溶剂时，4种组分的回收率均可达85%以上，并且杂质干扰较少，故最终选定乙腈作为提取试剂。
2.1.2 净化条件的选择
为了减少油脂等杂质对目标物分离的干扰，对提取液进行了固相萃取柱净化。比较了C18柱和中性氧化铝固相萃取柱的净化效果，结果表明中性氧化铝固相萃取柱去除油脂等杂质的效果更好，故选定中性氧化铝固相萃取柱作为净化柱。
2.2 质谱条件的优化
本实验首先采用1μg/mL的混标溶液，以蠕动泵样方式在电喷雾正离子模式下进行母离子全扫描，找出准确的分子离子作为母离子，然后以分子离子为母离子对其子离子进行全扫描，最后选取丰度较强的2个子离子，优化其锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，选取丰度较大并且响应稳定的来做定量离子。
2.3 标准图谱
在色谱质谱条件下，碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的保留时间分别是3.93min、2.47min、3.13min、2.15min，标准样品图谱具体见图1。
2.4 标准曲线、线性范围及检出限
在确定的色谱条件下对质量浓度为0，5，10，20，50，100，200，400μg/L的混合标准品分别进行测定，以各组分的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/L）进行线性回归。4种标准物质在5～100μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数均可达到0.999以上。以信噪比S/N=5计算4种标准物质的检测限，具体数据见表1。
2.5 回收率及精密度分析
在市场上购买的13种品牌麻辣豆制品样品中添加20、50、100μg/L的混合标物，经上述方法提取、净化处理后进行UPLC-MS/MS测定。结果表明：在此色谱条件下能很好的将4种目标物质分离。本研究按测量值和真实值计算回收率，5次重复计算变异系数，检测结果表明：13种样品中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的本底值均为0mg/kg，4种标准物质的平均回收率在84.5%～105.6%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～6.8%，满足回收率与精密度的要求。
3 结语
通过提取样品，固相萃取柱净化、超高效液相色谱分离和串联四极杆质谱检测，建立了麻辣豆制品中4种工业染料包括对碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O检测的UPLC-MS/MS方法。该方法前处理简单易操作，分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，可用于麻辣豆制品中上述4种非法添加工业染料的同时测定及确证。
参考文献
[1]GB/T 23496-2009食品中禁用物质的检测，碱性橙染料 高效液相色谱法.中华人民共和国国家标准.
[2]杨琳，陈青俊等.高效液相色谱法测定食品中3种碱性橙含量[M].理化检验-化学分册，2011，47（5）：768-770.
[3]DB35T 897-2009食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量的测定.福建省地方标准.
关键词：超高效液相色谱串联质谱 麻辣豆制品 工业染料
中图分类号：TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）06-0039-02
随着国内人们生活水平的提高，人们的饮食越来越趋近于多样化。麻辣豆制品，也在市场中占据了一席之地。某些不法商家为追求利润，在麻辣豆制品中加入碱性橙、碱性嫩黄O等工业染料，从而使其色泽更加鲜亮，但这些工业染料对人体有一定的毒副作用。人们长期食用添加过工业染料的豆制品，会对身体健康带来很大的安全隐患。国家、企业等相关单位对碱性橙2等工业染料检测有相关的报道及方法标准[1-3]，但能同时对3种碱性橙和碱性嫩黄O进行提取以及使用液相色谱质谱定量检测的方法还未见报道。
本研究建立了采用高效液相色谱串联质谱仪同时测定麻辣豆制品中非法添加的4种工业染料包括碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的检测分析方法，优化了提取及净化条件，可为市场上麻辣豆制品的检测提供方法参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
标准品购置：碱性橙2（99.9%）；碱性橙21（99.9%）；碱性橙22（99.9%）；碱性嫩黄O（99.8%）；甲醇，乙腈均为色谱纯；甲酸，分析纯；C18柱；中性氧化铝固相萃取柱及0.22μm有机滤膜均购于美瑞泰克科技（天津）有限公司。
液相色谱仪：岛津LC-30系列，日本岛津公司；质谱仪：API 4000配有电喷雾离子源（ESI）及数据处理系统，美国应用生物系统公司；超纯水机：美国Millipore公司。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液配制
储备液：准确称取碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O标准品各0.1g（精确至 0.001g），用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准品储备液，4℃冰箱保存备用。
工作液：储备液用甲醇逐级稀释，配制成系列工作液。
1.2.2 样品制备
提取；称取均质好的豆制品5g置于100mL烧杯中，加人乙腈10mL，超声提取10min，将提取液用滤纸过滤到圆底烧瓶中，再加人乙腈10mL，重复上述操作3次，合并提取液，转移提取液过中性氧化铝固相萃取柱，用少量乙腈冲洗残渣并过柱，定容至50mL，经0.22μm 微孔滤膜过滤后用于UPLC-MS/MS测定。
1.2.3 色谱、质谱条件
（1）液相色谱条件；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6×150 mm×3.5μm）；柱温为36℃；进样量为3μL；流动相：1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0～1 min，90%A；1～5.0min，90%～10%A；5.0～8min，90%A；流速为0.5mL/min。
（2）质谱条件；电喷雾离子源（ESI+）；离子源温度（TEM）为500℃；雾化气（GS1）为60psi；碰撞气（CAD）为 8psi；气帘气（CUR）为24psi；辅助加热器（GS2）为60psi；喷雾电压（IS）为5500V。
2 结果与讨论
2.1 提取与净化条件的优化
2.1.1 提取溶剂的选择
由于4种工业染料均溶于醇、水等多种溶剂，分别以甲醇、乙腈和水三种试剂进行提取。结果表明，以乙腈作为提取溶剂时，4种组分的回收率均可达85%以上，并且杂质干扰较少，故最终选定乙腈作为提取试剂。
2.1.2 净化条件的选择
为了减少油脂等杂质对目标物分离的干扰，对提取液进行了固相萃取柱净化。比较了C18柱和中性氧化铝固相萃取柱的净化效果，结果表明中性氧化铝固相萃取柱去除油脂等杂质的效果更好，故选定中性氧化铝固相萃取柱作为净化柱。
2.2 质谱条件的优化
本实验首先采用1μg/mL的混标溶液，以蠕动泵样方式在电喷雾正离子模式下进行母离子全扫描，找出准确的分子离子作为母离子，然后以分子离子为母离子对其子离子进行全扫描，最后选取丰度较强的2个子离子，优化其锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，选取丰度较大并且响应稳定的来做定量离子。
2.3 标准图谱
在色谱质谱条件下，碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的保留时间分别是3.93min、2.47min、3.13min、2.15min，标准样品图谱具体见图1。
2.4 标准曲线、线性范围及检出限
在确定的色谱条件下对质量浓度为0，5，10，20，50，100，200，400μg/L的混合标准品分别进行测定，以各组分的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/L）进行线性回归。4种标准物质在5～100μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数均可达到0.999以上。以信噪比S/N=5计算4种标准物质的检测限，具体数据见表1。
2.5 回收率及精密度分析
在市场上购买的13种品牌麻辣豆制品样品中添加20、50、100μg/L的混合标物，经上述方法提取、净化处理后进行UPLC-MS/MS测定。结果表明：在此色谱条件下能很好的将4种目标物质分离。本研究按测量值和真实值计算回收率，5次重复计算变异系数，检测结果表明：13种样品中碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O的本底值均为0mg/kg，4种标准物质的平均回收率在84.5%～105.6%，相对标准偏差（RSD）为1.4%～6.8%，满足回收率与精密度的要求。
3 结语
通过提取样品，固相萃取柱净化、超高效液相色谱分离和串联四极杆质谱检测，建立了麻辣豆制品中4种工业染料包括对碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O检测的UPLC-MS/MS方法。该方法前处理简单易操作，分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，可用于麻辣豆制品中上述4种非法添加工业染料的同时测定及确证。
参考文献
[1]GB/T 23496-2009食品中禁用物质的检测，碱性橙染料 高效液相色谱法.中华人民共和国国家标准.
[2]杨琳，陈青俊等.高效液相色谱法测定食品中3种碱性橙含量[M].理化检验-化学分册，2011，47（5）：768-770.
[3]DB35T 897-2009食品中碱性橙、碱性嫩黄O和碱性桃红T含量的测定.福建省地方标准.