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摘 要：乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。研究表明，乳腺癌的增殖及耐药是导致患者死亡的主要原因。因此，明确乳腺癌的发生发展机制，寻找有效的治疗靶点是延长乳腺癌患者生存时间的关键。最近研究表明，醌氧化还原酶在多种肿瘤中表达异常增高，并与肿瘤的不良预后密切相关。本研究通过在乳腺癌细胞株T47D中给予醌氧化还原酶抑制剂β-拉帕醌，观察其对乳腺癌细胞增殖作用的影响，并探讨可能的分子机制。
关键词：乳腺癌；细胞；蛋白
1 材料
1.1 试剂和仪器
DMEM细胞培养液、小牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司，MTT购自Sigma公司，β-拉帕醌购自Selleck公司；Bcl-2、Bax一抗购自Cell Signaling公司。
1.2 细胞培养
T47D细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液内，置于37℃培养箱中培养。细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代。
1.3 实验分组
对照组；β-拉帕醌高（8umol/L）、中（4umol/L）、低（2umol/L）剂量组。
2 方法
2.1 细胞增殖抑制实验
取对数增殖期细胞接种于96孔培养板，贴壁后给药，分别培养24、48、72 h。加入预先配制的MTT液50uL，37℃继续孵育4 h。加入150uL DMSO后，在波长490 nm处测定各孔光吸收值（A），按下列公式计算细胞增殖抑制率：
细胞增殖抑制率（%）
=[1-（A给药组-A空白对照组）/（A阴性对照组-A空白对照组）]×100
2.2 蛋白印迹法检测凋亡蛋白的表达
提取各组细胞蛋白，SDS-PAGE分离，电转并5%脱脂奶粉封闭，加入一抗4℃反应过夜；二抗室温反应60 min；ECL增强发光。以actin蛋白作内参照，图像分析软件进行半定量分析。
2.3 统计学处理
用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 细胞的增殖抑制作用
MTT检测结果显示， β-拉帕醌分别作用T47D细胞24、48和72h后，细胞增殖速度下降明显，结果见表1。
3.2 凋亡相关蛋白的表达
蛋白印迹检测结果显示， 用药组细胞bcl-2表达明显下降，而bax蛋白表达明显增加，用药组bcl-2/bax比值明显降低，见图2。
4 讨论
凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系。因此，诱导瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一个新热点。本实验中MTT结果显示β-拉帕醌对乳腺癌细胞T47D的增殖具有明显的抑制作用，并具有量效關系。
凋亡的过程受到多基因调控。Bcl-2和Bax是一对凋亡相关调控基因，Bcl-2主要通过与其家族成员Bax形成二聚体而发挥作用，当Bcl-2表达量较高时，Bcl-2和Bax形成异源二聚体而抑制凋亡；当Bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡。在本实验中，用药组Bcl-2蛋白表达则明显减弱，Bax蛋白表达明显增强，Bcl-2/Bax比值明显降低，说明β-拉帕醌可有效诱导乳腺癌细胞凋亡，这可能是抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。
参考文献：
[1] 石建伟，唐智柳，蔡美玉.2008～2012年我国女性乳腺癌流行状况的系统性综述.中国妇幼保健，2014，29：1622-1626.
[2] Fagerholm R，Sprott K，Heikkinen T，et al.Overabundant FANCD2，alone and combined with NQO1， is a sensitive marker of adverse prognosis in breast cancer. Ann Oncol. 2013， 24（11）：2780-5.
[3] Yao B T， Wu M， Wang B. Experimental research on repairing myocardial cells of viral myocarditis by study on inhibiting action of hydrochloric berberine on expression of bcl-2 in cells of precancerous lesion in experimental rat model. China journal of traditional chinese medicine and pharmacy，2005.20（3）：186-187.
基金项目：延边大学本科生创新课题（2015）
通讯作者：陈丽艳
关键词：乳腺癌；细胞；蛋白
1 材料
1.1 试剂和仪器
DMEM细胞培养液、小牛血清、胰蛋白酶购自Hyclone公司，MTT购自Sigma公司，β-拉帕醌购自Selleck公司；Bcl-2、Bax一抗购自Cell Signaling公司。
1.2 细胞培养
T47D细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液内，置于37℃培养箱中培养。细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代。
1.3 实验分组
对照组；β-拉帕醌高（8umol/L）、中（4umol/L）、低（2umol/L）剂量组。
2 方法
2.1 细胞增殖抑制实验
取对数增殖期细胞接种于96孔培养板，贴壁后给药，分别培养24、48、72 h。加入预先配制的MTT液50uL，37℃继续孵育4 h。加入150uL DMSO后，在波长490 nm处测定各孔光吸收值（A），按下列公式计算细胞增殖抑制率：
细胞增殖抑制率（%）
=[1-（A给药组-A空白对照组）/（A阴性对照组-A空白对照组）]×100
2.2 蛋白印迹法检测凋亡蛋白的表达
提取各组细胞蛋白，SDS-PAGE分离，电转并5%脱脂奶粉封闭，加入一抗4℃反应过夜；二抗室温反应60 min；ECL增强发光。以actin蛋白作内参照，图像分析软件进行半定量分析。
2.3 统计学处理
用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。
3 实验结果
3.1 细胞的增殖抑制作用
MTT检测结果显示， β-拉帕醌分别作用T47D细胞24、48和72h后，细胞增殖速度下降明显，结果见表1。
3.2 凋亡相关蛋白的表达
蛋白印迹检测结果显示， 用药组细胞bcl-2表达明显下降，而bax蛋白表达明显增加，用药组bcl-2/bax比值明显降低，见图2。
4 讨论
凋亡普遍存在于大多数肿瘤组织细胞中，与肿瘤的发生、发展及退化有密切的关系。因此，诱导瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一个新热点。本实验中MTT结果显示β-拉帕醌对乳腺癌细胞T47D的增殖具有明显的抑制作用，并具有量效關系。
凋亡的过程受到多基因调控。Bcl-2和Bax是一对凋亡相关调控基因，Bcl-2主要通过与其家族成员Bax形成二聚体而发挥作用，当Bcl-2表达量较高时，Bcl-2和Bax形成异源二聚体而抑制凋亡；当Bax表达较高时，bax之间形成同源二聚体而促进凋亡。在本实验中，用药组Bcl-2蛋白表达则明显减弱，Bax蛋白表达明显增强，Bcl-2/Bax比值明显降低，说明β-拉帕醌可有效诱导乳腺癌细胞凋亡，这可能是抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。
参考文献：
[1] 石建伟，唐智柳，蔡美玉.2008～2012年我国女性乳腺癌流行状况的系统性综述.中国妇幼保健，2014，29：1622-1626.
[2] Fagerholm R，Sprott K，Heikkinen T，et al.Overabundant FANCD2，alone and combined with NQO1， is a sensitive marker of adverse prognosis in breast cancer. Ann Oncol. 2013， 24（11）：2780-5.
[3] Yao B T， Wu M， Wang B. Experimental research on repairing myocardial cells of viral myocarditis by study on inhibiting action of hydrochloric berberine on expression of bcl-2 in cells of precancerous lesion in experimental rat model. China journal of traditional chinese medicine and pharmacy，2005.20（3）：186-187.
基金项目：延边大学本科生创新课题（2015）
通讯作者：陈丽艳