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摘 要：目的：通过不同的马立克氏病（Marek’s disease，MD）疫苗接种方法的比较，得出获得最佳免疫效果的免疫方法。方法：选取孵化示范基地，孵化5组试验鸡群，每组100羽，试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫 17日龄二免、鸡胚免疫 出生二免、空白对照，自60日龄起对试验鸡群抽样开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。结果：与对照组相比，4个疫苗免疫组的血清抗体效价、IFN-γ、IL-4水平均显著升高，同时MD的发病率显著下降，其中，以18日龄鸡胚免疫和鸡胚免疫 出生免疫效果最为显著。结论：鸡胚免疫技术能有效提高鸡马立克氏病疫苗的免疫效果。
关键词：鸡；马立克氏病；鸡胚免疫
中图分类号：S831.7 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180431003
鸡马立克病是由马立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起鸡的一种传染性肿瘤病，主要以各组织器官、神经、皮肤及虹膜和性腺形成肿瘤和淋巴组织增生为特征[1]。由于MDV可通过空气传播，且感染的鸡很快发病死亡，给养殖业带来了巨大的经济损失，MD是鸡的重要疫病之一，受到了国内外的重视。MD是目前已知的唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤疾病，无特效药物治疗，只能预防。但近年来发现，免疫鸡群往往由于早期感染，导致免疫失败，由于鸡胚发育后期的组织学基础研究[2] 和MD 鸡胚免疫保护效果[3，4] 的研究都表明，鸡胚在孵化后期已具备能够产生一定程度的免疫应答的组织基础。因此，本文用鸡胚免疫并结合常用的免疫方法对试验基地的鸡群进行试验，以期获得最佳的鸡马立克病疫苗免疫方法。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 种蛋
该试验是以溧阳市南渡宏伟种禽养殖场、南渡仁福养鸡场、南渡福兴苗禽有限公司3家规模种禽养殖（孵化）场为示范基地，共孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。
1.1.2 疫苗
试验组均免疫接种鸡马立克氏病Ⅰ Ⅲ型二价活疫苗（CVI988 FC126株），按照0.2mL/枚的量接种。
1.2 鸡胚孵化
试验所用的鸡胚在孵化之前用甲醛熏蒸消毒30min，37.5～38.5℃孵化，湿度62%，每小时翻蛋1次，使用大型電气自动孵化器孵化。
1.3 试验分组及免疫方法
本项目是在示范基地，孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫 17日龄二免、鸡胚免疫 出生二免、空白对照。自60日龄起对试验鸡群采血开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。每组随机抽取10羽鸡，通过试验检测数据分析，制定合理的鸡马立克氏病免疫方法并推广应用。
1.3.1 第1组：出生1日龄免疫
刚出生的仔鸡，进行胫部外侧肌肉注射稀释好的鸡马立克氏病Ⅰ Ⅲ型二价活疫苗0.2mL/枚。
1.3.2 第2组：18日龄鸡胚免疫
孵育至18日龄的鸡胚，用碘酊和酒精消毒鸡卵钝端的气室，6号针头在中央打孔，然后用5号注射器垂直进针，刺入全部针长注射二价活疫苗疫苗0.2mL/枚，最后用石蜡封口，继续常规孵化。
1.3.3 第3组：出生免疫 17日龄二免
将试验组的鸡群在出生和17日龄时均进行胫部外侧肌肉注射二价活疫苗，0.2mL/羽。
1.3.4 第4组：鸡胚免疫 出生二免
孵育18日龄后同上鸡胚免疫，0.2mL/枚；出生一日龄时胫部外侧肌肉进行二免，0.2mL/羽。
1.3.5 第5组：未免疫的对照组
1.4 试验室检测
1.4.1 间接ELISA法检测鸡马立克氏病病毒血清抗体
采用商业化的MDV血清抗体间接ELISA检测试剂盒，在酶标板条微孔上预包纯化的鸡MDV的抗原。一定时间后，加入稀释后的待检血清，经过温育后，血清样品中MDV的抗体与包被板上的抗原特异性的结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入HRP标记的兔抗鸡IgG酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。吸光度A值与样品中鸡马立克氏病病毒抗体成正相关。
1.4.2 各试验组鸡血清IFN-γ水平检测
IFN-γ由1型辅助性T细胞（Th1细胞）分泌产生，主要参与细胞免疫。因此血清中的IFN-γ水平，可以间接反映试验动物的细胞免疫水平。
应用双抗体夹心法测定标本中鸡γ干扰素（IFN-γ）水平。用纯化的鸡IFN-γ 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算血清样品中鸡IFN-γ浓度。
1.4.3 各试验组鸡血清IL-4水平检测
IL-4由2型辅助性T细胞（Th2细胞）分泌产生，主要参与体液免疫。因此血清中的IL-4水平，可以间接反映试验动物的体液免疫水平。
应用双抗体夹心法测定标本中鸡白介素4（IL-4）水平。用纯化的鸡IL-4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算血清样品中鸡IL-4浓度。 1.4.4 各试验组鸡发病率统计
观察并统计各试验组患有如下典型症状的病鸡的数量。如病鸡一侧腿发生不全或完全麻痹，站立不稳，两腿前后伸展，呈“劈叉”姿势。或精神萎顿，食欲减退，羽毛松乱，鸡冠苍白、皱缩，有的鸡冠呈黑紫色，黄白色或黄绿色下痢，迅速消瘦，胸骨似刀锋，触诊腹部能摸到硬块。病鸡脱水、昏迷，最后死亡。对疑似患病鸡进行病原PCR检测，以确定疾病是由MDV引起的。并采取患病鸡的肝等组织进行病理组织学检查。
2 试验结果
2.1 MDV血清抗体的检测
间接ELISA法检测结果表明（图1），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清抗体阳性率最高，可达95%，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清MDV抗体阳性率（88%）显著高于出生1日龄免疫试验组（73%），同时也高于出生免疫 17日龄二免试验组（82%）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的血清抗体，有效预防鸡MDV的感染。
2.2 血清IFN-γ水平的检测结果
双抗体夹心法测定结果表明（图2），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清IFN-γ水平最高，可达480 pg/mL，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清IFN-γ水平（445 pg/mL）显著高于出生1日龄免疫试验组（326 pg/mL），同時也高于出生免疫 17日龄二免试验组（383 pg/mL）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的细胞免疫反应，有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。
2.3 血清IL-4水平的检测结果
双抗体夹心法测定结果表明（图3），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清IL-4水平最高，可达168pg/mL，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清IL-4水平（134pg/mL）显著高于出生1日龄免疫试验组（115pg/mL），同时也高于出生免疫 17日龄二免试验组（125pg/mL）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的体液免疫反应，有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。
3.4 鸡群MD发病率的结果统计
观察及统计结果表明（表1），未免疫的空白对照组有22%的鸡感染MDV并发病，而进行疫苗免疫的试验组，MDV发病率显著降低。其中，鸡胚免疫 出生二免试验组的发病率最低，MDV发病率仅2%，免疫保护效果最好。
3 讨论
由试验结果可以看出，4个MD疫苗免疫组都显著提高了鸡血液中的抗体效价、IFN-γ、IL-4的水平，对鸡的免疫应答产生了很好的作用，且都显著降低了MD的发病率。其中，试验组鸡胚免疫 出生二免在提高机体对MDV的免疫和降低MD的发病率都起到了最好的免疫效果，其次是18日龄鸡胚免疫组。说明鸡胚免疫能够有效地提高MD疫苗的免疫效果。
参考文献
[1]B.W.卡尔尼克.高福，等译.禽病学（第10版） [M].北京：中国农业出版社，1999：465-529.
[2]鲍恩东，陈万芳.鸡胚免疫系统器官组织学变化观察[J].中国兽医科技，1996，26（2）：26-27.
[3]古飞霞，辛朝安.鸡马立克氏病鸡胚免疫接种的研究[J].中国兽医科技，1990（4）：4-7.
[4]鲍恩东，陈万芳，张贤，等.马立克氏病鸡胚免疫的保护力试验[J].中国兽医科技，1997，27（1）：21-22.
关键词：鸡；马立克氏病；鸡胚免疫
中图分类号：S831.7 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180431003
鸡马立克病是由马立克病病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起鸡的一种传染性肿瘤病，主要以各组织器官、神经、皮肤及虹膜和性腺形成肿瘤和淋巴组织增生为特征[1]。由于MDV可通过空气传播，且感染的鸡很快发病死亡，给养殖业带来了巨大的经济损失，MD是鸡的重要疫病之一，受到了国内外的重视。MD是目前已知的唯一可用疫苗成功预防的病毒性肿瘤疾病，无特效药物治疗，只能预防。但近年来发现，免疫鸡群往往由于早期感染，导致免疫失败，由于鸡胚发育后期的组织学基础研究[2] 和MD 鸡胚免疫保护效果[3，4] 的研究都表明，鸡胚在孵化后期已具备能够产生一定程度的免疫应答的组织基础。因此，本文用鸡胚免疫并结合常用的免疫方法对试验基地的鸡群进行试验，以期获得最佳的鸡马立克病疫苗免疫方法。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 种蛋
该试验是以溧阳市南渡宏伟种禽养殖场、南渡仁福养鸡场、南渡福兴苗禽有限公司3家规模种禽养殖（孵化）场为示范基地，共孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。
1.1.2 疫苗
试验组均免疫接种鸡马立克氏病Ⅰ Ⅲ型二价活疫苗（CVI988 FC126株），按照0.2mL/枚的量接种。
1.2 鸡胚孵化
试验所用的鸡胚在孵化之前用甲醛熏蒸消毒30min，37.5～38.5℃孵化，湿度62%，每小时翻蛋1次，使用大型電气自动孵化器孵化。
1.3 试验分组及免疫方法
本项目是在示范基地，孵化饲养五组试验鸡群，每组100羽。试验组分别采取出生1日龄免疫、18日龄鸡胚免疫、出生免疫 17日龄二免、鸡胚免疫 出生二免、空白对照。自60日龄起对试验鸡群采血开展体液免疫检测、细胞免疫检测、病理检测等试验室检测工作。每组随机抽取10羽鸡，通过试验检测数据分析，制定合理的鸡马立克氏病免疫方法并推广应用。
1.3.1 第1组：出生1日龄免疫
刚出生的仔鸡，进行胫部外侧肌肉注射稀释好的鸡马立克氏病Ⅰ Ⅲ型二价活疫苗0.2mL/枚。
1.3.2 第2组：18日龄鸡胚免疫
孵育至18日龄的鸡胚，用碘酊和酒精消毒鸡卵钝端的气室，6号针头在中央打孔，然后用5号注射器垂直进针，刺入全部针长注射二价活疫苗疫苗0.2mL/枚，最后用石蜡封口，继续常规孵化。
1.3.3 第3组：出生免疫 17日龄二免
将试验组的鸡群在出生和17日龄时均进行胫部外侧肌肉注射二价活疫苗，0.2mL/羽。
1.3.4 第4组：鸡胚免疫 出生二免
孵育18日龄后同上鸡胚免疫，0.2mL/枚；出生一日龄时胫部外侧肌肉进行二免，0.2mL/羽。
1.3.5 第5组：未免疫的对照组
1.4 试验室检测
1.4.1 间接ELISA法检测鸡马立克氏病病毒血清抗体
采用商业化的MDV血清抗体间接ELISA检测试剂盒，在酶标板条微孔上预包纯化的鸡MDV的抗原。一定时间后，加入稀释后的待检血清，经过温育后，血清样品中MDV的抗体与包被板上的抗原特异性的结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入HRP标记的兔抗鸡IgG酶标二抗，与检测板上的抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物；在微孔中加入TMB底物液，经酶催化形成蓝色产物，加入终止液终止反应后，用酶标仪450nm波长测定反应孔中的吸光度A值。吸光度A值与样品中鸡马立克氏病病毒抗体成正相关。
1.4.2 各试验组鸡血清IFN-γ水平检测
IFN-γ由1型辅助性T细胞（Th1细胞）分泌产生，主要参与细胞免疫。因此血清中的IFN-γ水平，可以间接反映试验动物的细胞免疫水平。
应用双抗体夹心法测定标本中鸡γ干扰素（IFN-γ）水平。用纯化的鸡IFN-γ 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算血清样品中鸡IFN-γ浓度。
1.4.3 各试验组鸡血清IL-4水平检测
IL-4由2型辅助性T细胞（Th2细胞）分泌产生，主要参与体液免疫。因此血清中的IL-4水平，可以间接反映试验动物的体液免疫水平。
应用双抗体夹心法测定标本中鸡白介素4（IL-4）水平。用纯化的鸡IL-4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入待检血清，再与HRP标记的羊抗鼠酶标抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算血清样品中鸡IL-4浓度。 1.4.4 各试验组鸡发病率统计
观察并统计各试验组患有如下典型症状的病鸡的数量。如病鸡一侧腿发生不全或完全麻痹，站立不稳，两腿前后伸展，呈“劈叉”姿势。或精神萎顿，食欲减退，羽毛松乱，鸡冠苍白、皱缩，有的鸡冠呈黑紫色，黄白色或黄绿色下痢，迅速消瘦，胸骨似刀锋，触诊腹部能摸到硬块。病鸡脱水、昏迷，最后死亡。对疑似患病鸡进行病原PCR检测，以确定疾病是由MDV引起的。并采取患病鸡的肝等组织进行病理组织学检查。
2 试验结果
2.1 MDV血清抗体的检测
间接ELISA法检测结果表明（图1），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清抗体阳性率最高，可达95%，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清MDV抗体阳性率（88%）显著高于出生1日龄免疫试验组（73%），同时也高于出生免疫 17日龄二免试验组（82%）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的血清抗体，有效预防鸡MDV的感染。
2.2 血清IFN-γ水平的检测结果
双抗体夹心法测定结果表明（图2），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清IFN-γ水平最高，可达480 pg/mL，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清IFN-γ水平（445 pg/mL）显著高于出生1日龄免疫试验组（326 pg/mL），同時也高于出生免疫 17日龄二免试验组（383 pg/mL）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的细胞免疫反应，有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。
2.3 血清IL-4水平的检测结果
双抗体夹心法测定结果表明（图3），鸡鸡胚免疫 出生二免试验组的鸡血清IL-4水平最高，可达168pg/mL，显著高于其他试验组。18日龄鸡胚免疫试验组的鸡血清IL-4水平（134pg/mL）显著高于出生1日龄免疫试验组（115pg/mL），同时也高于出生免疫 17日龄二免试验组（125pg/mL）。证实鸡马立克氏病病毒疫苗18日龄鸡胚免疫可以诱导免疫动物产生高水平的体液免疫反应，有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。
3.4 鸡群MD发病率的结果统计
观察及统计结果表明（表1），未免疫的空白对照组有22%的鸡感染MDV并发病，而进行疫苗免疫的试验组，MDV发病率显著降低。其中，鸡胚免疫 出生二免试验组的发病率最低，MDV发病率仅2%，免疫保护效果最好。
3 讨论
由试验结果可以看出，4个MD疫苗免疫组都显著提高了鸡血液中的抗体效价、IFN-γ、IL-4的水平，对鸡的免疫应答产生了很好的作用，且都显著降低了MD的发病率。其中，试验组鸡胚免疫 出生二免在提高机体对MDV的免疫和降低MD的发病率都起到了最好的免疫效果，其次是18日龄鸡胚免疫组。说明鸡胚免疫能够有效地提高MD疫苗的免疫效果。
参考文献
[1]B.W.卡尔尼克.高福，等译.禽病学（第10版） [M].北京：中国农业出版社，1999：465-529.
[2]鲍恩东，陈万芳.鸡胚免疫系统器官组织学变化观察[J].中国兽医科技，1996，26（2）：26-27.
[3]古飞霞，辛朝安.鸡马立克氏病鸡胚免疫接种的研究[J].中国兽医科技，1990（4）：4-7.
[4]鲍恩东，陈万芳，张贤，等.马立克氏病鸡胚免疫的保护力试验[J].中国兽医科技，1997，27（1）：21-22.