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Kod DNA聚合酶作为常见的高保真DNA聚合酶，具有较强的DNA延伸能力以及3’-5’外切核酸酶校正活性。本研究通过对重组Kod DNA聚合酶分离纯化条件的优化，以期提高其表达和纯化效率以及片段扩增能力。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）对pET-30a-Kod进行诱导表达后，利用酶溶法和超声波破碎法对细胞破碎并提取粗酶液，然后利用Ni-NTA柱洗脱纯化获得较纯Kod DNA酶，再经透析得到高纯度Kod DNA酶，利用PCR反应和Sanger测序手段来检测自提纯化的Kod DNA聚合酶活性及保真性。同时，本研究对IPTG浓度和洗脱液中咪唑浓度等重要参数进行优化。结果表明，在28℃条件下0.1 mmol/L IPTG诱导16-18 h后，Kod DNA聚合酶高效表达；当咪唑浓度为200 mmol/L时蛋白洗脱效果最佳。PCR反应体系中Mg2+浓度为1.5 mmol/L，Kod DNA聚合酶浓度为0.061 25 μg/μL时，Kod DNA聚合酶效率较高，能有效地扩增3 194 bp的目的条带；通过序列比对，PCR产物序列中未引入任何突变。经优化制备后的Kod DNA聚合酶在酶活性和扩增保真性上均能达到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究为节省实验室PCR成本，进一步开发和利用Kod DNA聚合酶奠定一定的基础。