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摘要 [目的]优化枯草芽孢杆菌CK15的发酵条件，提高其芽孢产量。[方法]通过单因素试验优化碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、无机盐种类、装液量、摇床转速、初始pH、温度、接种量，采用Plackett-Burman试验筛选出培养基中的显著因素，再利用Box-Behnken试验确定3个因素的最佳浓度。[结果]在玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO3 7.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO4 0.4 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、装液量50 mL/250 mL、转速为200 r/min、初始pH 7.2、温度30 ℃、接种量2.0%条件下，芽孢产量达到7.4×109 cfu/mL，比优化前提高了80.49%。[结论]响应面法有效提高了枯草芽孢杆菌CK15的芽孢产量。
关键词 枯草芽孢杆菌；芽孢；响应面法
中图分类号 S144文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-025-05
Abstract [Objective] To optimize the fermentation condition of Bacillus subtilis CK15 and to enhance the Spore Production yield. [Method] Single factor test was used to optimize the type and concentration of carbon source， type and concentration of nitrogen source， the type of inorganic salt， loaded liquid volume， shaker speed， initial pH， temperature and inoculum size. The optimal concentrations of three factors were determined by Plackett-Burman design； and the optimal concentrations of three factors were obtained by Box-Behnken test. [Result] The spore production was 7.4 × 109 cfu/mL under the conditions of 10.7 g/L corn flour， 24.4 g/L soybean meal powder， 7.4 g/L CaCO3， 5 g/L NaCl， 0.4 g/L MnSO4， 1.0 g/L KH2PO4， 50 mL/250 mL loaded liquid volume， 200 r/min rotation speed， initial pH 7.2， 30 ℃ temperature， and 2 % inoculation amount. Thus， the spore production increased by 80.49% than before. [Conclusion] The response surface method effectively improves the spore production of Bacillus subtilis CK15.
Key words Bacillus subtilis； Spore； Response surface method
微生物肥料能够增加土地肥力，净化修复土壤，抑制植物对有害物质的吸收，减少农作物病虫害发生，改善农产品品质[1]。枯草芽孢杆菌是一类普遍存在于植物表面的革兰氏阳性好氧型细菌，可产生耐热抗逆性强的芽孢，对人畜无毒无害，不污染环境[2]。目前，世界上主要选用玉米粉、豆粕粉作为枯草芽孢杆菌发酵的碳源[3]和氮源[4]。Greene曾报道大量CaCO3能够通过调节pH来强烈启动芽孢的生成[5]。枯草芽孢杆菌的微生态制剂可以作为饲料或肥料的添加剂来防治动物疾病和植物病害，制剂中活菌数是衡量其质量的重要指标[6]。枯草芽孢杆菌在生物防治上的应用报道很多[7-8]。微生态制剂中的活菌数会随着其存放时间的延长而减少，最终影响其使用效果，而制成干粉剂型有利于微生物制剂的储藏[9]。
响应面法具有试验周期短、回归方程精度高、可以研究多种因素间交互作用等优点[10-13]。笔者以单因素试验为基础，通过Plackett-Burman试验研究了影响枯草芽孢杆菌CK15的芽孢产量的显著因子，然后通过最陡爬坡试验靠近最优区域，最后根据Box-Behnken试验研究了最佳发酵条件，旨在为提高枯草芽孢杆菌的芽孢产量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CK15，由广西大学生命科学与技术学院保存。
1.1.2 试验材料与试剂。糖蜜、木薯淀粉、麸皮、玉米粉、豆粕粉、玉米浆干粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、尿素、硫酸铵、CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2均为国产分析纯。
1.1.3 培养基。种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。碳源基础培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。氮源基础培养基：葡萄糖 5 g/L，NaCl 5 g/L。无机盐基础培养基：葡萄糖 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化。取斜面保藏菌种划线至平板上，28 ℃恒温倒置培养1 d。 1.2.2 种子培养。用接种环从活化好的平板上刮取菌株，接种至装有100 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养12 h至对数期。
1.2.3 发酵培养。按2%的量接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养48 h。
1.2.4 芽孢检测。取1 mL发酵液至EP管中，置于80 ℃恒温水浴锅中20 min，取出EP管冷却至室温，取0.1 mL发酵液至装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，然后再取0.1 mL稀释好的发酵液0.1 mL至另一管装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，依次稀释至合适浓度，取0.1 mL稀释好的发酵液涂平板。将平板置于28 ℃恒温培养箱培养24 h，计数平板上的菌落数[14]。
1.2.5 单因素试验。研究碳源种类（蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉、木薯淀粉、麸皮、葡萄糖、玉米粉）及筛选出的最佳碳源浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源种类（豆粕粉、玉米浆干粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵）及筛选出的最佳氮源浓度（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、无机盐种类（CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2）、装液量（50、75、100、125、150 mL）、摇床转速（140、160、180、200、220 r/min）、初始pH（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）、发酵温度（26、28、30、32、34 ℃）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）对芽孢产量的影响。
1.2.6 Plackett-Burman试验。在单因素试验的基础上，以芽孢量（cfu/mL）为响应值，选择A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、G（NaCl）、H（MnSO4）6个因素进行Plackett-Burman试验，另设3个虚拟项作为误差分析，每个因素取高（+1）、低（-1）2个水平。用minitab.V17.1.0软件考察各个因素对芽孢产量的重要性，试验设计见表1。
1.2.7 最陡爬坡试验。以Plackett-Burman 试验筛选出的显著因素，用单因素试验结果设计步长，因素为正效应步长递增，负效应步长递减。其他因素取单因素最佳水平，进行最陡爬坡试验，接近芽孢产量最大值区域。
1.2.8 Box-Behnken 试验。Box-Behnken 法可用于 2～5 个因素的优化试验，每个因素取 3 个水平。根据试验表得到结果后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次多项回归模型，对该模型进行方差和回归分析，在一定水平范围内得到芽孢产量的最佳值。用筛选出的影响芽孢产量最显著的3个因素进行三水平的中心组设计。根据Plackett-Burman试验得到的数据结果，对预测模型斜率是正值的因素，适当提高其水平，斜率是负值的因素，适当降低其水平，不显著的单因素取单因素试验最佳值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
由图1可知，以玉米粉为碳源，浓度为1%时芽孢产量最高；豆粕粉浓度为2%时，芽孢产量最高；过高过低的C/N都不利于芽孢的积累；CaCO3、MnSO4、KH2PO4、NaCl对芽孢产量影响显著；装液量为在50 mL、转速为220 r/min时，芽孢产量最高，但与200 r/min时相比芽孢产量增幅不大，所以选择200 r/min为最佳转速；芽孢产量先增后减，当pH为7.2、温度为30 ℃、接种量为2%时芽孢产量最高。单因素试验只考虑各因素的最优值，未考虑因素之间相互作用，所得发酵条件未必为最优条件。
2.2 Plackett-Burman 试验结果
由表2可知，整个模型显著，A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、H（MnSO4）5个因素影响显著。由p-value值可知，影响重要性大小依次为B（豆粕粉）、A（玉米粉）、E（CaCO3）、D（KH2PO4）、H（MnSO4），选取前3个影响较大因素进一步试验。
2.3 最陡爬坡试验结果
根据Plackett-Burman试验结果，以芽孢产量的梯度方向为爬坡方向，根据T值可知各因素对芽孢产量的影响，玉米粉为负效应，豆粕粉和CaCO3为正效应，其余3个因素均取最低水平。由表3可知，第2组试验芽孢产量最高，说明最优点在第2组试验附近。选择第2组为响应面中心点，即玉米粉10.5 g/L、豆粕粉24.0 g/L、CaCO3 7.5 g/L，进一步试验。
2.4 响应面试验结果
由最陡爬坡试验结果所得中心点，运用minitab.V17.1.0创建Box-Benhnken进行响应面分析，试验设计及结果见表4。
运行minitab.V17.1.0软件对响应者进行多元回归拟合并进行方差分析。结果表明，该模型决定系数R2=0.989 4>0.9，校正决定系数R2Adj=0.970 3，说明响应面97.03%的变化可由该模型解释，表明该模型拟合度良好。
以芽孢产量（Y）为响应值，各试验因素对响应值的影响可用下列函数表示：
Y= -880.5 + 45.2X1+21.20X2+104.35X3-2.900X21-0.588 9X22- 5.900X23+0.933X1X2-0.800X1X3-0.333X2X3
芽孢产量（Y）响应值最大时的各因素水平为：X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。
发酵最优条件为：玉米粉10.7 g/L，豆粕粉24.4 g/L，CaCO3 7.4 g/L，NaCl 5.0 g/L，MnSO4 0.4 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，装液量50 mL/250 mL，转速200 r/min，初始pH 7.2，温度30 ℃，接种量2.0%。在上述条件下对试验结果进行预测和分析。优化发酵条件试验结果表明，发酵条件优化后的芽孢产量比优化前大大提高（表5）。 运用minitab.V17.1.0软件可得到3个重要因子之间的响应面曲面图及其等高线图。等高线的形状反映因子交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著。
由图2可知，CaCO3浓度一定时，随着玉米粉和豆粕粉的不断增加，芽孢产量开始不断提高，后期小幅度下降。一定程度上增加玉米粉有利于芽孢产生，但过多的玉米粉导致C/N过高，不利于芽孢产量的提高。
由图3可知，当豆粕粉一定时，芽孢产量随玉米粉和CaCO3的不断增加而先增加后减少，说明碳源的过高或过低都不利于芽孢的积累。CaCO3对芽孢产量影响较显著，表现为较陡的曲面，玉米粉对芽孢产量的影响较小，曲面平滑。
由图4可知，豆粕粉与CaCO3的交互作用影响小于玉米粉与CaCO3。在玉米粉一定时，随着豆粕粉和CaCO3的不断增加，芽孢产量呈现开始上升，到达最高点后下降。豆粕粉和CaCO3对芽孢产量都有较大影响，合适的豆粕粉和CaCO3浓度有利于芽孢的积累。
2.5 模型的验证
综合响应面结果分析，应用minitab.V17.1.0软件分析得出芽孢产量的最佳发酵条件为X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。采用上诉最优条件进行试验，得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL与预测值7.638 1×109 cfu/mL接近，表明该模型能较好地预测实际芽孢产量情况。
3 结论
在单因素试验的基础上，应用Plackett-Burman试验从众多因素中筛选出显著因素分别为玉米粉、豆粕粉、CaCO3。用爬坡试验靠近最大值范围，通过Box-Behnken试验得到显著因素的最佳水平，最终得出最佳发酵条件为：玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO3 7.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO4 0.4 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、装液量50 mL/250 mL、转速为200 r/min、初始pH 7.2、温度30 ℃、接种量2.0%。实际得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL，比优化前提高了80.49%，与预测值接近，表明预测模型可用于实际生产中。
参考文献
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[13] 梁昌聪，郭立佳，刘磊，等.响应面法优化解淀粉芽孢杆菌C101发酵培养基[J].生物技术通报，2014（8）：169-174.
[14] 杜连祥.微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2005.
关键词 枯草芽孢杆菌；芽孢；响应面法
中图分类号 S144文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）20-025-05
Abstract [Objective] To optimize the fermentation condition of Bacillus subtilis CK15 and to enhance the Spore Production yield. [Method] Single factor test was used to optimize the type and concentration of carbon source， type and concentration of nitrogen source， the type of inorganic salt， loaded liquid volume， shaker speed， initial pH， temperature and inoculum size. The optimal concentrations of three factors were determined by Plackett-Burman design； and the optimal concentrations of three factors were obtained by Box-Behnken test. [Result] The spore production was 7.4 × 109 cfu/mL under the conditions of 10.7 g/L corn flour， 24.4 g/L soybean meal powder， 7.4 g/L CaCO3， 5 g/L NaCl， 0.4 g/L MnSO4， 1.0 g/L KH2PO4， 50 mL/250 mL loaded liquid volume， 200 r/min rotation speed， initial pH 7.2， 30 ℃ temperature， and 2 % inoculation amount. Thus， the spore production increased by 80.49% than before. [Conclusion] The response surface method effectively improves the spore production of Bacillus subtilis CK15.
Key words Bacillus subtilis； Spore； Response surface method
微生物肥料能够增加土地肥力，净化修复土壤，抑制植物对有害物质的吸收，减少农作物病虫害发生，改善农产品品质[1]。枯草芽孢杆菌是一类普遍存在于植物表面的革兰氏阳性好氧型细菌，可产生耐热抗逆性强的芽孢，对人畜无毒无害，不污染环境[2]。目前，世界上主要选用玉米粉、豆粕粉作为枯草芽孢杆菌发酵的碳源[3]和氮源[4]。Greene曾报道大量CaCO3能够通过调节pH来强烈启动芽孢的生成[5]。枯草芽孢杆菌的微生态制剂可以作为饲料或肥料的添加剂来防治动物疾病和植物病害，制剂中活菌数是衡量其质量的重要指标[6]。枯草芽孢杆菌在生物防治上的应用报道很多[7-8]。微生态制剂中的活菌数会随着其存放时间的延长而减少，最终影响其使用效果，而制成干粉剂型有利于微生物制剂的储藏[9]。
响应面法具有试验周期短、回归方程精度高、可以研究多种因素间交互作用等优点[10-13]。笔者以单因素试验为基础，通过Plackett-Burman试验研究了影响枯草芽孢杆菌CK15的芽孢产量的显著因子，然后通过最陡爬坡试验靠近最优区域，最后根据Box-Behnken试验研究了最佳发酵条件，旨在为提高枯草芽孢杆菌的芽孢产量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CK15，由广西大学生命科学与技术学院保存。
1.1.2 试验材料与试剂。糖蜜、木薯淀粉、麸皮、玉米粉、豆粕粉、玉米浆干粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、尿素、硫酸铵、CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2均为国产分析纯。
1.1.3 培养基。种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。碳源基础培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。氮源基础培养基：葡萄糖 5 g/L，NaCl 5 g/L。无机盐基础培养基：葡萄糖 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化。取斜面保藏菌种划线至平板上，28 ℃恒温倒置培养1 d。 1.2.2 种子培养。用接种环从活化好的平板上刮取菌株，接种至装有100 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养12 h至对数期。
1.2.3 发酵培养。按2%的量接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养48 h。
1.2.4 芽孢检测。取1 mL发酵液至EP管中，置于80 ℃恒温水浴锅中20 min，取出EP管冷却至室温，取0.1 mL发酵液至装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，然后再取0.1 mL稀释好的发酵液0.1 mL至另一管装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，依次稀释至合适浓度，取0.1 mL稀释好的发酵液涂平板。将平板置于28 ℃恒温培养箱培养24 h，计数平板上的菌落数[14]。
1.2.5 单因素试验。研究碳源种类（蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉、木薯淀粉、麸皮、葡萄糖、玉米粉）及筛选出的最佳碳源浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源种类（豆粕粉、玉米浆干粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵）及筛选出的最佳氮源浓度（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、无机盐种类（CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2）、装液量（50、75、100、125、150 mL）、摇床转速（140、160、180、200、220 r/min）、初始pH（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）、发酵温度（26、28、30、32、34 ℃）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）对芽孢产量的影响。
1.2.6 Plackett-Burman试验。在单因素试验的基础上，以芽孢量（cfu/mL）为响应值，选择A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、G（NaCl）、H（MnSO4）6个因素进行Plackett-Burman试验，另设3个虚拟项作为误差分析，每个因素取高（+1）、低（-1）2个水平。用minitab.V17.1.0软件考察各个因素对芽孢产量的重要性，试验设计见表1。
1.2.7 最陡爬坡试验。以Plackett-Burman 试验筛选出的显著因素，用单因素试验结果设计步长，因素为正效应步长递增，负效应步长递减。其他因素取单因素最佳水平，进行最陡爬坡试验，接近芽孢产量最大值区域。
1.2.8 Box-Behnken 试验。Box-Behnken 法可用于 2～5 个因素的优化试验，每个因素取 3 个水平。根据试验表得到结果后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次多项回归模型，对该模型进行方差和回归分析，在一定水平范围内得到芽孢产量的最佳值。用筛选出的影响芽孢产量最显著的3个因素进行三水平的中心组设计。根据Plackett-Burman试验得到的数据结果，对预测模型斜率是正值的因素，适当提高其水平，斜率是负值的因素，适当降低其水平，不显著的单因素取单因素试验最佳值。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
由图1可知，以玉米粉为碳源，浓度为1%时芽孢产量最高；豆粕粉浓度为2%时，芽孢产量最高；过高过低的C/N都不利于芽孢的积累；CaCO3、MnSO4、KH2PO4、NaCl对芽孢产量影响显著；装液量为在50 mL、转速为220 r/min时，芽孢产量最高，但与200 r/min时相比芽孢产量增幅不大，所以选择200 r/min为最佳转速；芽孢产量先增后减，当pH为7.2、温度为30 ℃、接种量为2%时芽孢产量最高。单因素试验只考虑各因素的最优值，未考虑因素之间相互作用，所得发酵条件未必为最优条件。
2.2 Plackett-Burman 试验结果
由表2可知，整个模型显著，A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、H（MnSO4）5个因素影响显著。由p-value值可知，影响重要性大小依次为B（豆粕粉）、A（玉米粉）、E（CaCO3）、D（KH2PO4）、H（MnSO4），选取前3个影响较大因素进一步试验。
2.3 最陡爬坡试验结果
根据Plackett-Burman试验结果，以芽孢产量的梯度方向为爬坡方向，根据T值可知各因素对芽孢产量的影响，玉米粉为负效应，豆粕粉和CaCO3为正效应，其余3个因素均取最低水平。由表3可知，第2组试验芽孢产量最高，说明最优点在第2组试验附近。选择第2组为响应面中心点，即玉米粉10.5 g/L、豆粕粉24.0 g/L、CaCO3 7.5 g/L，进一步试验。
2.4 响应面试验结果
由最陡爬坡试验结果所得中心点，运用minitab.V17.1.0创建Box-Benhnken进行响应面分析，试验设计及结果见表4。
运行minitab.V17.1.0软件对响应者进行多元回归拟合并进行方差分析。结果表明，该模型决定系数R2=0.989 4>0.9，校正决定系数R2Adj=0.970 3，说明响应面97.03%的变化可由该模型解释，表明该模型拟合度良好。
以芽孢产量（Y）为响应值，各试验因素对响应值的影响可用下列函数表示：
Y= -880.5 + 45.2X1+21.20X2+104.35X3-2.900X21-0.588 9X22- 5.900X23+0.933X1X2-0.800X1X3-0.333X2X3
芽孢产量（Y）响应值最大时的各因素水平为：X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。
发酵最优条件为：玉米粉10.7 g/L，豆粕粉24.4 g/L，CaCO3 7.4 g/L，NaCl 5.0 g/L，MnSO4 0.4 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，装液量50 mL/250 mL，转速200 r/min，初始pH 7.2，温度30 ℃，接种量2.0%。在上述条件下对试验结果进行预测和分析。优化发酵条件试验结果表明，发酵条件优化后的芽孢产量比优化前大大提高（表5）。 运用minitab.V17.1.0软件可得到3个重要因子之间的响应面曲面图及其等高线图。等高线的形状反映因子交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著。
由图2可知，CaCO3浓度一定时，随着玉米粉和豆粕粉的不断增加，芽孢产量开始不断提高，后期小幅度下降。一定程度上增加玉米粉有利于芽孢产生，但过多的玉米粉导致C/N过高，不利于芽孢产量的提高。
由图3可知，当豆粕粉一定时，芽孢产量随玉米粉和CaCO3的不断增加而先增加后减少，说明碳源的过高或过低都不利于芽孢的积累。CaCO3对芽孢产量影响较显著，表现为较陡的曲面，玉米粉对芽孢产量的影响较小，曲面平滑。
由图4可知，豆粕粉与CaCO3的交互作用影响小于玉米粉与CaCO3。在玉米粉一定时，随着豆粕粉和CaCO3的不断增加，芽孢产量呈现开始上升，到达最高点后下降。豆粕粉和CaCO3对芽孢产量都有较大影响，合适的豆粕粉和CaCO3浓度有利于芽孢的积累。
2.5 模型的验证
综合响应面结果分析，应用minitab.V17.1.0软件分析得出芽孢产量的最佳发酵条件为X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。采用上诉最优条件进行试验，得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL与预测值7.638 1×109 cfu/mL接近，表明该模型能较好地预测实际芽孢产量情况。
3 结论
在单因素试验的基础上，应用Plackett-Burman试验从众多因素中筛选出显著因素分别为玉米粉、豆粕粉、CaCO3。用爬坡试验靠近最大值范围，通过Box-Behnken试验得到显著因素的最佳水平，最终得出最佳发酵条件为：玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO3 7.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO4 0.4 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、装液量50 mL/250 mL、转速为200 r/min、初始pH 7.2、温度30 ℃、接种量2.0%。实际得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL，比优化前提高了80.49%，与预测值接近，表明预测模型可用于实际生产中。
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