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摘要：目的：研究保真汤抗结核的作用机制。方法：将保真汤含药血清作用于卡介苗活化的人单核-巨噬细胞U937，利用ELISA法检测细胞因子IL-12的含量。结果：与空白对照组相比，只有保真汤组高剂量组IL-12分泌量显著增多（p<0.05），卡介苗作用组有IL-12分泌量减少的趋势（P>0.05），保真汤中低剂量组与空白组相比IL-12分泌量差别不大；与卡介苗作用组相比，保真汤组高剂量组细胞IL-12分泌量显著增多（P<0.05），保真汤中低剂量组亦有使其分泌量增多的趋势。结论：保真汤通过增加巨噬细胞的IL-12分泌量，这可能是保真汤抗结核的作用机制的一部分。
关键词：保真汤；卡介苗；IL-12
中图分类号：R186 .2 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）10-0061-02
机体感染结核分支杆菌时，首先激活巨噬细胞，巨噬细胞把结核分枝杆菌固定于巨噬细胞表面；吞噬溶酶体溶解病原体；杀伤细菌或抑制其生长；吸引、募集其他的免疫细胞到达炎症发生部位并且把抗原提呈給T细胞激发获得性免疫[1]，进一步清除细菌，因此巨噬细胞在清除结核分支杆菌的过程中起至关重要的作用。
保真汤出自我国现存治疗肺痨的专书《十药神书》，为治疗肺痨的传统有效方，目前在临床上治疗肺结核也有很多成功的报道，所以本研究以保真汤含药血清作用于卡介苗（卡介苗）活化的单核-巨噬细胞，通过检测细胞因子IL-12分泌量的变化，初探保真汤治疗结核病的作用机制。
一、材料
1.动物和细胞：新西兰白兔雄性，体重2.0±0.2kg，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物合格证号为SCXK（吉）-2016-0004。人单核-巨噬细胞U937，转引自长春中医药大学免疫实验室。
2.药品与试剂：皮内注射卡介苗（上海生物制品研究所，50mg/只）；佛波酯（PMA）（Promega公司）；RPMI1640培养基、新生牛血清、胰酶（均购自Gibco公司）；Human IL-12 ELISA试剂盒（eBioscience公司）。
二、实验方法
1.保真汤的制备：取当归人参、生地黄、熟地黄、白术、黄芪各100g；赤茯苓、白茯苓、陈皮、厚朴各75g；麦门冬、赤芍药1、白芍药、知母、黄柏、五味子、柴胡、地骨皮各100g；甘草50g，天门冬100钱，常规煎煮后，浓缩液为2g生药/ml、4g生药/ml、8g生药/ml，置于4℃冰箱内备用。
2.家兔含药血清的制备：将白兔随机分为空白对照、保真汤高剂量组、保真汤中剂量组、保真汤低剂量组，每组5只。每组动物分别给予相同体积的药物10mL/kg，每日1次，空白对照组灌服等量生理盐水，每日一次，灌胃4d。于最后一次灌胃后1h心脏采血（最后一次给药前禁食不禁水12h），常规分离血清，同组动物血清混匀，56℃灭活30min后，经0.22μm，微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃冰箱内备用。
3.细胞传代培养：将细胞接种于含10%灭活新生小牛血清的RPMI1640培养基溶液中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中恒温培养，用细胞计数板计数，当细胞密度达到2×106/mL时进行传代培养，使细胞密度维持在1×105/mL—2×106/mL。离心获取传代6次后，密度达5×105/mL的U937细胞，使用预温的RPMI1640培养液进行洗涤，加入10ng/mL的佛波酯（PMA），混匀后接种细胞悬液到12孔培养板中，每孔1mL，再置于37℃、5%CO2、细胞培养箱中孵育48h。可见细胞伸出伪足，贴壁生长。用预温的RPMI1640培养液洗涤培养板，使未贴壁的细胞去除。经PMA处理后的贴壁细胞放在不含PMA及血清的培养基中培养24h，用在下一步实验。
4.卡介苗作用于巨噬细胞：取已培养24h的巨噬细胞，将其分为5组：空白对照组、卡介苗作用组、保真汤高剂量组、保真汤中剂量组、保真汤低剂量组，每组3复孔。经含药血清作用24h后（空白对照组、卡介苗作用组使用空白血清），于各组细胞除空白对照组外培养液中加入卡介苗混悬液，使其终浓度为0.125mg/ml，空白对照组加入等量RPMI1640培养液。
5.IL-12分泌量测定K：收集经卡介苗作用24小时后细胞培养上清，以ELISA法检测各组细胞IL-12。
三、实验结果
与空白对照组相比，只有保真汤组高剂量组IL-12分泌量显著增多（p<0.05），卡介苗作用组有IL-12分泌量减少的趋势（P>0.05），保真汤中低剂量组与空白组相比IL-12分泌量差别不大；与卡介苗作用组相比，保真汤组高剂量组细胞IL-12分泌量显著增多（P<0.05），保真汤中低剂量组亦有使其分泌量增多的趋势。
四、讨论
巨噬细胞在细胞免疫中起到很重要的效应器作用，在结核分枝杆菌和其他细胞因子的刺激下，能够产生很多细胞因子，如：IFN-γ，IL-10，IL-12、IL-23[2]等，其中IL-12能够诱导IFN-γ的产生，抑制IL-4的产生，调节1型细胞因子和2型细胞因子之间的平衡，这对于幼稚性T细胞向Thl分化是十分重要的[3]。本研究结果显示保真汤高剂量组可使巨噬细胞IL-12分泌量增加，所以可以推测保真汤通过增加巨噬细胞的IL-12分泌量，从而增强了天然免疫和特异性免疫之间的联系，这可能是保真汤抗结核的作用机制的一部分。
参考文献：
[1]Alamelu Raja.Immunology of tuberculosis [J]. Indian Med Res120，2004：213-232.
[2]Verreck FA，DeBoer T， Langenberg DM，et al. Human IL-23 producing type 1 macrophages promote but IL-10 producing type 2 macrophages subvert immunity to （myco） bacteria[J] .Proc Natl Acad Sci USA，2004，107（13）：4560-4565
[3]陈敬，董德琼，杨渝洁，等.白细胞介素12对结核病患者TH-1/TH-2平衡的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25（5）：292-295
关键词：保真汤；卡介苗；IL-12
中图分类号：R186 .2 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）10-0061-02
机体感染结核分支杆菌时，首先激活巨噬细胞，巨噬细胞把结核分枝杆菌固定于巨噬细胞表面；吞噬溶酶体溶解病原体；杀伤细菌或抑制其生长；吸引、募集其他的免疫细胞到达炎症发生部位并且把抗原提呈給T细胞激发获得性免疫[1]，进一步清除细菌，因此巨噬细胞在清除结核分支杆菌的过程中起至关重要的作用。
保真汤出自我国现存治疗肺痨的专书《十药神书》，为治疗肺痨的传统有效方，目前在临床上治疗肺结核也有很多成功的报道，所以本研究以保真汤含药血清作用于卡介苗（卡介苗）活化的单核-巨噬细胞，通过检测细胞因子IL-12分泌量的变化，初探保真汤治疗结核病的作用机制。
一、材料
1.动物和细胞：新西兰白兔雄性，体重2.0±0.2kg，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，动物合格证号为SCXK（吉）-2016-0004。人单核-巨噬细胞U937，转引自长春中医药大学免疫实验室。
2.药品与试剂：皮内注射卡介苗（上海生物制品研究所，50mg/只）；佛波酯（PMA）（Promega公司）；RPMI1640培养基、新生牛血清、胰酶（均购自Gibco公司）；Human IL-12 ELISA试剂盒（eBioscience公司）。
二、实验方法
1.保真汤的制备：取当归人参、生地黄、熟地黄、白术、黄芪各100g；赤茯苓、白茯苓、陈皮、厚朴各75g；麦门冬、赤芍药1、白芍药、知母、黄柏、五味子、柴胡、地骨皮各100g；甘草50g，天门冬100钱，常规煎煮后，浓缩液为2g生药/ml、4g生药/ml、8g生药/ml，置于4℃冰箱内备用。
2.家兔含药血清的制备：将白兔随机分为空白对照、保真汤高剂量组、保真汤中剂量组、保真汤低剂量组，每组5只。每组动物分别给予相同体积的药物10mL/kg，每日1次，空白对照组灌服等量生理盐水，每日一次，灌胃4d。于最后一次灌胃后1h心脏采血（最后一次给药前禁食不禁水12h），常规分离血清，同组动物血清混匀，56℃灭活30min后，经0.22μm，微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃冰箱内备用。
3.细胞传代培养：将细胞接种于含10%灭活新生小牛血清的RPMI1640培养基溶液中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中恒温培养，用细胞计数板计数，当细胞密度达到2×106/mL时进行传代培养，使细胞密度维持在1×105/mL—2×106/mL。离心获取传代6次后，密度达5×105/mL的U937细胞，使用预温的RPMI1640培养液进行洗涤，加入10ng/mL的佛波酯（PMA），混匀后接种细胞悬液到12孔培养板中，每孔1mL，再置于37℃、5%CO2、细胞培养箱中孵育48h。可见细胞伸出伪足，贴壁生长。用预温的RPMI1640培养液洗涤培养板，使未贴壁的细胞去除。经PMA处理后的贴壁细胞放在不含PMA及血清的培养基中培养24h，用在下一步实验。
4.卡介苗作用于巨噬细胞：取已培养24h的巨噬细胞，将其分为5组：空白对照组、卡介苗作用组、保真汤高剂量组、保真汤中剂量组、保真汤低剂量组，每组3复孔。经含药血清作用24h后（空白对照组、卡介苗作用组使用空白血清），于各组细胞除空白对照组外培养液中加入卡介苗混悬液，使其终浓度为0.125mg/ml，空白对照组加入等量RPMI1640培养液。
5.IL-12分泌量测定K：收集经卡介苗作用24小时后细胞培养上清，以ELISA法检测各组细胞IL-12。
三、实验结果
与空白对照组相比，只有保真汤组高剂量组IL-12分泌量显著增多（p<0.05），卡介苗作用组有IL-12分泌量减少的趋势（P>0.05），保真汤中低剂量组与空白组相比IL-12分泌量差别不大；与卡介苗作用组相比，保真汤组高剂量组细胞IL-12分泌量显著增多（P<0.05），保真汤中低剂量组亦有使其分泌量增多的趋势。
四、讨论
巨噬细胞在细胞免疫中起到很重要的效应器作用，在结核分枝杆菌和其他细胞因子的刺激下，能够产生很多细胞因子，如：IFN-γ，IL-10，IL-12、IL-23[2]等，其中IL-12能够诱导IFN-γ的产生，抑制IL-4的产生，调节1型细胞因子和2型细胞因子之间的平衡，这对于幼稚性T细胞向Thl分化是十分重要的[3]。本研究结果显示保真汤高剂量组可使巨噬细胞IL-12分泌量增加，所以可以推测保真汤通过增加巨噬细胞的IL-12分泌量，从而增强了天然免疫和特异性免疫之间的联系，这可能是保真汤抗结核的作用机制的一部分。
参考文献：
[1]Alamelu Raja.Immunology of tuberculosis [J]. Indian Med Res120，2004：213-232.
[2]Verreck FA，DeBoer T， Langenberg DM，et al. Human IL-23 producing type 1 macrophages promote but IL-10 producing type 2 macrophages subvert immunity to （myco） bacteria[J] .Proc Natl Acad Sci USA，2004，107（13）：4560-4565
[3]陈敬，董德琼，杨渝洁，等.白细胞介素12对结核病患者TH-1/TH-2平衡的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2002，25（5）：292-295