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【摘 要】目的：探讨序列特异性引物——聚合酶链反应（PCR-SSP）法、流式细胞仪（FCM）法及微量淋巴细胞毒（MLCT）法检测血清人类白细胞抗原-B27（HLA-B27）对强直性脊柱炎的诊断价值。方法：将58例确诊的强直性脊柱炎患者作为观察组，58例健康体检者作为对照组，分别采用PCR-SSP法、FCM法及MLCT法检测血清HLA-B27，分析3种方法诊断强直性脊柱炎的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。结果：PCR-SSP法、FCM法、MLCT法检测血清HLA-B27诊断强直性脊柱炎的灵敏度分别为96.55%、93.10%、82.76%，特异度分别为94.83%、91.38%、93.10%；PCR-SSP法、FCM法的灵敏度显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；3种方法均有较高的特异度，差异无统计学意义
（P > 0.05）；PCR-SSP法具有较高灵敏度和特异度。阳性预测值分别为94.92%、91.53%、92.31%，阴性预测值分别为96.49%、92.98%、84.38%。3种方法均有较高的阳性预测值，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法的阴性预测值显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高的阳性预测值和阴性预测值。结论：3种检测方法对诊断强直性脊柱炎均有较高的特异度和阳性预测值，PCR-SSP法具有较高灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。
【关键词】 脊柱炎，强直性；序列特异性引物-聚合酶链式反应；流式细胞仪；微量淋巴细胞毒；HLA-B27；比较分析
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是以
骶髂关节和脊柱慢性炎症为主的全身性疾病，国内发病率为0.3%左右，男女比例约为4～10∶1，以20～30岁为发病高峰年龄[1]。HLA-B27与AS具有很强的关联性，是AS诊断和鉴别诊断的重要依据。目前，实验室检测HLA-B27方法较多，笔者采用序列特异性引物——聚合酶链式反应（PCR-SSP）法、流式细胞仪（FCM）法及微量淋巴细胞毒（MLCT）法3种常用检测方法对58例AS患者进行了HLA-B27测定，计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，分析对AS诊断的价值，报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 选取2012年1月至2013年12月
在本院就诊的AS患者58例作为观察组，同时选取58例同期查体健康者作为对照组。观察组男
48例，女10例；年龄18～56岁，平均（30.8±7.9）岁。
对照组男47例，女11例；年龄19～55岁，平均（35.8±8.5）岁。
1.2 诊断标准 符合1984年美国风湿病学会（ACR）
修订的AS纽约诊断标准[2]。
2 方 法
2.1 检测方法 两组均抽取空腹静脉血3 mL，分别采用下述3种方法检测血清HLA-B27。
2.1.1 PCR-SSP法 采用天根DNA提取试剂盒，自乙二胺四乙酸（EDNA）抗凝的静脉血中提取模板DNA。使用HLA-B27分型试剂盒、ABI9700PCR仪，每孔反应体系包括Master buffer 10 μL、DNA 2 μL、Taq酶0.06 μL，反应条件为96 ℃预变性2.5 min，
96 ℃变性15 s，65 ℃退火60 s，共10个循环；95 ℃
变性15 s，62 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共22个
循环。配制含0.5 μL·mL-1溴化乙啶质量分数2%的琼脂糖凝胶，将12 μL聚合酶链反应产物依序加到电泳胶孔中，以10 V·cm-1电压强度电泳至酚红条带移动0.7～1.0 cm。电泳完毕后，将电泳胶移至Bio-Rad凝胶成像系统上，摄取影像进行结果判断。HLA-B27基因阳性者核酸片段大小为140 bp，
内部对照组核酸片段大小为600 bp。
2.1.2 FCM法 采用美国BD公司FACS Aria流式细胞仪、HLA-B27试剂盒。反应管中加入10 μL抗HLA-B27 FITC/CD3PE，再加入30 μL抗凝血，震荡后室温孵育15 min，加入1∶10稀释的溶血素1 mL，震荡后室温孵育10 min；离心弃上清，加入2 mL PBS洗涤1次；离心弃上清，加入300 μL
PBS溶液，震荡后上机检测。
2.1.3 MLCT法 取外周静脉血3 mL，用淋巴细胞分离液梯度密度法分离淋巴细胞备用。向包被好抗体的血清板孔底加入1 μL淋巴细胞悬液、1 μL新鲜溶解的兔补体，室温下孵育1 h，加入荧光终止剂终止反应。在Olympus荧光倒置显微镜下观察，呈红色者为死细胞，绿色者为活细胞。每孔淋巴细胞死亡率≤20%积2分，21%～40%积4分，41%～80%积6分， > 80%积8分。平均1～2分
为阴性，3分为可疑，4～8分为阳性。
2.2 观察方法
2.2.1 根据灵敏度和特异度观察3种检测方法对AS诊断的价值 灵敏度又称真阳性率，是实际有病而按该筛检实验的标准被正确判断为有病的百分比，即患者中得出阳性检测的样本占患者总数的百分比，它反映筛检实验发现患者的能力。特异度又称真阴性率，是实际无病而按该诊断标准被正确地判断为无病的百分比，即健康人中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比，它反映筛检实验确定非患者的能力。
2.2.2 分析3种检测方法对AS诊断的预测值 即根据诊断性试验的结果判断受试者的患病概率的大小。阳性预测值是在诊断试验为阳性的受试者中，标准诊断有病的病例（真阳性）所占的比例；阴性预测值则是在诊断试验为阴性的受试者中，标准诊断证实无病的受试者（真阴性）所占的比例。 2.2.3 诊断价值参数计算公式 灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×
100%。阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例
数+假阳性例数）×100%。阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%。
2.3 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计分析。组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学
意义。
3 结 果
3.1 两组血清HLA-B27检测表达情况比较 两组间HLA-B27阳性率比较，观察组高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。
3.2 3种检测方法对诊断AS的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值价值参数比较 PCR-SSP法、FCM法检测血清HLA-B27对AS的诊断灵敏度显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；
3种检测方法对诊断AS均有较高的特异度，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法具有较高灵敏度和特异度。3种检测方法对诊断AS均有较高的阳性预测值，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法检测血清HLA-B27对AS的诊断的阴性预测值显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高阳性预测值和阴性预测值。见表2。
4 讨 论
HLA分布在有核细胞表面，在决定机体对自身免疫病的易感性方面具有重要作用，目前只有HLA-B27常被用于风湿病的诊断[3]。经血清学方法检测证实，HLA-B27是在HLA-B位点上的等位基因，也是第一个被发现与疾病密切相关的等位基因。HLA-B27与AS强相关，AS患者HLA-B27的阳性率为90%以上，而在正常人群中仅为6%～8%。在HLA-B27阳性者中，仅0.95%～9.5%患有AS（阳性预测值），因此尽管HLA-B27检查对于AS具有高度特异性和敏感性，但其检测结果既不能作为诊断依据，也不能预见患者的预后，只能增加诊断的可能性[4]。如临床症状和体征提示患者为脊柱关节炎，HLA-B27阳性将显著增加正确诊断机会；炎性关节病变的儿童，HLA-B27阳性提示发生AS的可能性大；HLA-B27阳性预测AS患者家庭成员发生AS的可能性；AS患者的子女中HLA-B27阳性者发生AS的可能性大。尤其女性AS的症状及体征不太典型，且易累及外周关节，X线示骶髂关节表现不明显，易被误诊[5]。HLA-B27的检测结果有助于AS诊断。
检测HLA-B27的方法有多种，如FCM法、MCLT法、酶联免疫吸附法、免疫磁珠法及相关的基因分型法等。实验室检测HLA-B27已成为临床诊断和鉴别AS的重要辅助手段，因此选择一种有效、利于AS诊断的HLA-B27检测方法尤为重要。临床普遍采用的MLCT法，操作简便、易行，不足之处是检测需要新鲜血液和足够的活淋巴细胞，检测时很难获得高效价的单价血清，且由于受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性影响，易出现漏检或假阳性，标本不能长期保存，也不能送其他实验室检测等。FCM法亦快捷、简便，不足之处也是检测需要新鲜抗凝血液，标本也不能长期保存，基层单位多数没有流式细胞仪等。目前，国内外广泛采用的PCR-SSP B27等位基因的特定核酸序列，经PCR方法扩增出特异的HLA-B27基因片段，较FCM法更为快速、简便，具有高灵敏度和特异度。
本研究显示，PCR-SSP法、FCM（下转第19页）
（上接第15页）法及MLCT法3种方法检测血清HLA-B27对诊断AS的特异度均较高，且差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法诊断灵敏度均显著高于MLCT法，差异有统计学意义
（P < 0.05）；PCR-SSP法灵敏度和特异度最高。3种
检测方法的阳性预测值均较高，差异无统计学意义
（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法阴性预测值均显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高阳性预测值和阴性预测值。
检测结果与检测方法有密切关系，是因为PCR-SSP法检测的是HLA-B27基因型，血清学技术检测的是HLA-B27表型，而携带B27基因者细胞表面并不一定有B27抗原表达。经PCR-SSP法检测为阳性，FCM法及MLCT法检测为阴性的标本也可能与患者细胞表面HLA-B27抗原不表达有关。在灵敏度上，本次研究中PCR-SSP法灵敏度低于李慧琰[6]研究的98.75%，高于陈建华等[7]研究的94.80%，试验结果存在偏倚，可能与试验样本量差异有关。
总之，PCR-SSP法检测HLA-B27是一种表达快速、简单、有效的检测方法，对AS诊断具有较高灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，对临床适用性较好。
5 参考文献
[1] 张乃峥.临床风湿病学[M].上海：上海科学技术出版社，1999：156-173.
[2] 中华医学会风湿病学分会.强直性脊柱炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2010，14（8）：557-559.
[3] Susan J，Bartlett PhD.风湿病综合治疗[M].3版.叶志中，高诚，译.沈阳：辽宁科学技术出版社，2008：
44-45.
[4] 黄烽.强直性脊柱炎[M].北京：人民卫生出版社，2011：74-76.
[5] 潘宏伟，李满意.女性强直性脊柱炎40例临床分
析[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：51，53.
[6] 李慧琰.PCR-SSP法与微量淋巴细胞毒试验检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较[J].医药论坛杂志，2010，31（5）：78-79.
[7] 陈建华，魏文宁，喻喜.PCR-SSP法与流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较[J].检验医学与临床，2007，4（3）：161-162.
收稿日期：2014-07-25；修回日期：2014-08-26
（P > 0.05）；PCR-SSP法具有较高灵敏度和特异度。阳性预测值分别为94.92%、91.53%、92.31%，阴性预测值分别为96.49%、92.98%、84.38%。3种方法均有较高的阳性预测值，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法的阴性预测值显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高的阳性预测值和阴性预测值。结论：3种检测方法对诊断强直性脊柱炎均有较高的特异度和阳性预测值，PCR-SSP法具有较高灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。
【关键词】 脊柱炎，强直性；序列特异性引物-聚合酶链式反应；流式细胞仪；微量淋巴细胞毒；HLA-B27；比较分析
强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是以
骶髂关节和脊柱慢性炎症为主的全身性疾病，国内发病率为0.3%左右，男女比例约为4～10∶1，以20～30岁为发病高峰年龄[1]。HLA-B27与AS具有很强的关联性，是AS诊断和鉴别诊断的重要依据。目前，实验室检测HLA-B27方法较多，笔者采用序列特异性引物——聚合酶链式反应（PCR-SSP）法、流式细胞仪（FCM）法及微量淋巴细胞毒（MLCT）法3种常用检测方法对58例AS患者进行了HLA-B27测定，计算灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，分析对AS诊断的价值，报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 选取2012年1月至2013年12月
在本院就诊的AS患者58例作为观察组，同时选取58例同期查体健康者作为对照组。观察组男
48例，女10例；年龄18～56岁，平均（30.8±7.9）岁。
对照组男47例，女11例；年龄19～55岁，平均（35.8±8.5）岁。
1.2 诊断标准 符合1984年美国风湿病学会（ACR）
修订的AS纽约诊断标准[2]。
2 方 法
2.1 检测方法 两组均抽取空腹静脉血3 mL，分别采用下述3种方法检测血清HLA-B27。
2.1.1 PCR-SSP法 采用天根DNA提取试剂盒，自乙二胺四乙酸（EDNA）抗凝的静脉血中提取模板DNA。使用HLA-B27分型试剂盒、ABI9700PCR仪，每孔反应体系包括Master buffer 10 μL、DNA 2 μL、Taq酶0.06 μL，反应条件为96 ℃预变性2.5 min，
96 ℃变性15 s，65 ℃退火60 s，共10个循环；95 ℃
变性15 s，62 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共22个
循环。配制含0.5 μL·mL-1溴化乙啶质量分数2%的琼脂糖凝胶，将12 μL聚合酶链反应产物依序加到电泳胶孔中，以10 V·cm-1电压强度电泳至酚红条带移动0.7～1.0 cm。电泳完毕后，将电泳胶移至Bio-Rad凝胶成像系统上，摄取影像进行结果判断。HLA-B27基因阳性者核酸片段大小为140 bp，
内部对照组核酸片段大小为600 bp。
2.1.2 FCM法 采用美国BD公司FACS Aria流式细胞仪、HLA-B27试剂盒。反应管中加入10 μL抗HLA-B27 FITC/CD3PE，再加入30 μL抗凝血，震荡后室温孵育15 min，加入1∶10稀释的溶血素1 mL，震荡后室温孵育10 min；离心弃上清，加入2 mL PBS洗涤1次；离心弃上清，加入300 μL
PBS溶液，震荡后上机检测。
2.1.3 MLCT法 取外周静脉血3 mL，用淋巴细胞分离液梯度密度法分离淋巴细胞备用。向包被好抗体的血清板孔底加入1 μL淋巴细胞悬液、1 μL新鲜溶解的兔补体，室温下孵育1 h，加入荧光终止剂终止反应。在Olympus荧光倒置显微镜下观察，呈红色者为死细胞，绿色者为活细胞。每孔淋巴细胞死亡率≤20%积2分，21%～40%积4分，41%～80%积6分， > 80%积8分。平均1～2分
为阴性，3分为可疑，4～8分为阳性。
2.2 观察方法
2.2.1 根据灵敏度和特异度观察3种检测方法对AS诊断的价值 灵敏度又称真阳性率，是实际有病而按该筛检实验的标准被正确判断为有病的百分比，即患者中得出阳性检测的样本占患者总数的百分比，它反映筛检实验发现患者的能力。特异度又称真阴性率，是实际无病而按该诊断标准被正确地判断为无病的百分比，即健康人中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比，它反映筛检实验确定非患者的能力。
2.2.2 分析3种检测方法对AS诊断的预测值 即根据诊断性试验的结果判断受试者的患病概率的大小。阳性预测值是在诊断试验为阳性的受试者中，标准诊断有病的病例（真阳性）所占的比例；阴性预测值则是在诊断试验为阴性的受试者中，标准诊断证实无病的受试者（真阴性）所占的比例。 2.2.3 诊断价值参数计算公式 灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×
100%。阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例
数+假阳性例数）×100%。阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%。
2.3 统计学方法 采用SPSS 11.0软件进行统计分析。组间比较采用t检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学
意义。
3 结 果
3.1 两组血清HLA-B27检测表达情况比较 两组间HLA-B27阳性率比较，观察组高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。
3.2 3种检测方法对诊断AS的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值价值参数比较 PCR-SSP法、FCM法检测血清HLA-B27对AS的诊断灵敏度显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；
3种检测方法对诊断AS均有较高的特异度，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法具有较高灵敏度和特异度。3种检测方法对诊断AS均有较高的阳性预测值，差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法检测血清HLA-B27对AS的诊断的阴性预测值显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高阳性预测值和阴性预测值。见表2。
4 讨 论
HLA分布在有核细胞表面，在决定机体对自身免疫病的易感性方面具有重要作用，目前只有HLA-B27常被用于风湿病的诊断[3]。经血清学方法检测证实，HLA-B27是在HLA-B位点上的等位基因，也是第一个被发现与疾病密切相关的等位基因。HLA-B27与AS强相关，AS患者HLA-B27的阳性率为90%以上，而在正常人群中仅为6%～8%。在HLA-B27阳性者中，仅0.95%～9.5%患有AS（阳性预测值），因此尽管HLA-B27检查对于AS具有高度特异性和敏感性，但其检测结果既不能作为诊断依据，也不能预见患者的预后，只能增加诊断的可能性[4]。如临床症状和体征提示患者为脊柱关节炎，HLA-B27阳性将显著增加正确诊断机会；炎性关节病变的儿童，HLA-B27阳性提示发生AS的可能性大；HLA-B27阳性预测AS患者家庭成员发生AS的可能性；AS患者的子女中HLA-B27阳性者发生AS的可能性大。尤其女性AS的症状及体征不太典型，且易累及外周关节，X线示骶髂关节表现不明显，易被误诊[5]。HLA-B27的检测结果有助于AS诊断。
检测HLA-B27的方法有多种，如FCM法、MCLT法、酶联免疫吸附法、免疫磁珠法及相关的基因分型法等。实验室检测HLA-B27已成为临床诊断和鉴别AS的重要辅助手段，因此选择一种有效、利于AS诊断的HLA-B27检测方法尤为重要。临床普遍采用的MLCT法，操作简便、易行，不足之处是检测需要新鲜血液和足够的活淋巴细胞，检测时很难获得高效价的单价血清，且由于受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性影响，易出现漏检或假阳性，标本不能长期保存，也不能送其他实验室检测等。FCM法亦快捷、简便，不足之处也是检测需要新鲜抗凝血液，标本也不能长期保存，基层单位多数没有流式细胞仪等。目前，国内外广泛采用的PCR-SSP B27等位基因的特定核酸序列，经PCR方法扩增出特异的HLA-B27基因片段，较FCM法更为快速、简便，具有高灵敏度和特异度。
本研究显示，PCR-SSP法、FCM（下转第19页）
（上接第15页）法及MLCT法3种方法检测血清HLA-B27对诊断AS的特异度均较高，且差异无统计学意义（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法诊断灵敏度均显著高于MLCT法，差异有统计学意义
（P < 0.05）；PCR-SSP法灵敏度和特异度最高。3种
检测方法的阳性预测值均较高，差异无统计学意义
（P > 0.05）；PCR-SSP法、FCM法阴性预测值均显著高于MLCT法，差异有统计学意义（P < 0.05）；PCR-SSP法具有较高阳性预测值和阴性预测值。
检测结果与检测方法有密切关系，是因为PCR-SSP法检测的是HLA-B27基因型，血清学技术检测的是HLA-B27表型，而携带B27基因者细胞表面并不一定有B27抗原表达。经PCR-SSP法检测为阳性，FCM法及MLCT法检测为阴性的标本也可能与患者细胞表面HLA-B27抗原不表达有关。在灵敏度上，本次研究中PCR-SSP法灵敏度低于李慧琰[6]研究的98.75%，高于陈建华等[7]研究的94.80%，试验结果存在偏倚，可能与试验样本量差异有关。
总之，PCR-SSP法检测HLA-B27是一种表达快速、简单、有效的检测方法，对AS诊断具有较高灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，对临床适用性较好。
5 参考文献
[1] 张乃峥.临床风湿病学[M].上海：上海科学技术出版社，1999：156-173.
[2] 中华医学会风湿病学分会.强直性脊柱炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2010，14（8）：557-559.
[3] Susan J，Bartlett PhD.风湿病综合治疗[M].3版.叶志中，高诚，译.沈阳：辽宁科学技术出版社，2008：
44-45.
[4] 黄烽.强直性脊柱炎[M].北京：人民卫生出版社，2011：74-76.
[5] 潘宏伟，李满意.女性强直性脊柱炎40例临床分
析[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：51，53.
[6] 李慧琰.PCR-SSP法与微量淋巴细胞毒试验检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较[J].医药论坛杂志，2010，31（5）：78-79.
[7] 陈建华，魏文宁，喻喜.PCR-SSP法与流式细胞仪检测强直性脊柱炎患者HLA-B27的比较[J].检验医学与临床，2007，4（3）：161-162.
收稿日期：2014-07-25；修回日期：2014-08-26