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摘要：采用RAPD技术对叠氮化钠（NaN3）诱变的凤尾鸡冠花耐盐突变体进行遗传特性分析。结果表明：从98个随机引物中筛选出12条适于凤尾鸡冠花的引物，共扩增出104条带，对照和突变体扩增的总条带数分别为49和55，其中9个引物出现差异条带，3个引物未出现差异性条带，凤尾鸡冠花耐盐突变体与对照差异较大，变异率为31.73%，说明了NaN3能有效诱导凤尾鸡冠花的基因变异。
关键词：凤尾鸡冠花；耐盐突变体；RAPD鉴定
基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究（吉教科合字〔2013〕第471号）
中图分类号： S681.3 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048
随机扩增多态性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，简称RAPD）是建立在PCR基础之上的检测DNA多态性的分子标记技术[1]，其利用PCR随机合成多态性DNA片段，检测被扩增区域内遗传特性变化，该技术的实施不依赖于种属的特异性和基因组的结构，无需制备探针，DNA用量少，分子识别率高，对环境污染小，成本低，已在分类学研究、品种鉴定、遗传作图等方面得到了广泛的应用[2-3]。目前，运用RAPD技术已经成功的发现了众多的突变型[4，5]。试验对NaN3诱变的凤尾鸡冠花耐盐突变体进行RAPD分析，进一步鉴定耐盐突变体的遗传稳定性，为凤尾鸡冠花耐盐新品系的诱变育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
材料：凤尾鸡冠花组培苗经NaN3诱变初筛获得的耐盐突变体。
主要试剂：随机引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取缓冲液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-异戊醇（24︰1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、异丙醇、乙醇、DNA分子量标准等，所有试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取及检测 参照赵曦[6]等的CTAB法，以未经处理的凤尾鸡冠花组培苗为对照，分别提取对照和初筛耐盐突变体的基因组DNA，并采用紫外风光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法对所提基因组进行鉴定。
1.2.2凤尾鸡冠耐盐突变体的RAPD检测
1.2.2.1引物筛选及RAPD反应 从上海生工生物工程技术有限公司购进98个随机引物（10个碱基），以对照和耐盐突变体基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，筛选出突变体与对照间具多态性的特异引物。
采用20μL的RAPD反应体系，分别为：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm随机引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O补充。反应程序为： 94 ℃预变性5分钟；94 ℃变性1分钟，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分钟，42 个循环；72 ℃再延伸10分钟；4 ℃保温。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离和分析。
1.2.2.2RAPD标记分析 通过筛选引物，检测凤尾鸡冠花耐盐突变体相对于对照在DNA分子水平上的变化，获得突变体与对照间的多态性基因位点，以稳定而清晰的条带作为统计数据，对试验数据进行统计分析，计算变异率[7]。
2 结果与分析
2.1基因组DNA的纯度和浓度检测
采用CTAB法提取得到的DNA颜色呈无色透明状，较粘稠，易溶于TE溶液。对照和突变体DNA样品OD260/OD280都在1.80-1.92之间，OD260/OD230都在1.98～2.10之间，表明所提DNA样品中蛋白和RNA污染较少，DNA纯度较高，凝胶电泳结果如图1所示，基因组条带清晰、整齐、明亮，无弥散现象，点样孔清晰，可进行下一步实验。
2.2 引物的筛选及RAPD分析
用98个随机引物对凤尾鸡冠花耐盐突变体及其对照进行RAPD分析，结果发现有12条引物可扩增出清晰、明亮、多态性较好的条带（表1），对凤尾鸡冠花对照和初筛获得的耐盐突变体进行了RAPD分析，发现12个随机引物中，9个引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出现差异条带，3个引物（S98、S117、S440）未出现差异性条带，其余引物均没有扩增出条带，图2为多态性最好的3个随机引物（S87、S432、S435）的扩增图。12个可扩增引物共扩增出104条带，其中对照和突变体分别扩增的总条带数为49和55，扩增片段大小在100-2000bp之间。RAPD扩增结果中出现了新增或缺失条带，与对照相比，突变体新增条带11条，缺失条带12条，凤尾鸡冠花耐盐突变体与对照差异较大，变异率为31.73%，充分说明了NaN3结合组织培养技术能有效地诱导凤尾鸡冠花基因变异。
3 讨论
RAPD是一种有效的检测基因差异的技术，该技术已经应用于体外诱变育种引起的DNA多态性分析，凤尾鸡冠花组培苗经NaN3处理后，结合植物组织培养技术，在半致死剂量的NaCl胁迫下诱变耐盐突变体，RAPD扩增结果差异显著。与对照相比，扩增带型出现了差异，这些差异带型主要有扩增条带的消失、增加以及扩增条带的强弱变化。引起扩增带消失或新增的原因肯是引物互补位点发生碱基突变，或互补位点间的DNA发生插入或缺失，或插入片段过大，这些都能导致差异片段的出现。引起扩增条带强度变化的原因可能是多拷贝引物结合位点上某些碱基发生突变，使引物结合量减少，造成DNA量减少，或是新增片段与原有某片段的分子量相近，使谱带加深，即反映出谱带深浅的变化。这些差异充分说明NaN3诱变结合体细胞无性系变异能引起遗传物质发生丰富的变异。
参考文献
[1]白玉.DNA分子标记技术及其应用[J].安徽农业科学，2007，35（24）：7422-7424.
[2]董喜存，李文建，余丽霞，等.用随机扩增多态性DNA技术对重离了辐照大丽花花色突变体的初步研究[J].辐射研究与辐射工艺学报，2007，25（01）：62-64.
[3]潘宁，赵琦，土振莲，等.矮化早熟高粱突变体的RAPD分析[J].生物技术通报，2005（02）：29-31.
[4]马升华，姚艳玲，钱丽华，等.组培获得大花蕙兰叶色突变体的RAPD分析[J].杭州农业科技，2007（03）：11-13.
[5]李明飞，谢彦周，刘录祥，等.叠氮化钠诱变普通小麦陕农33突变体库的构建和初步评估[J].麦类作物学报，2015，35（01）：22-29.
[6]赵曦，王广金，李铁，等.大豆空间诱变突变体的RAPD分析[J].核农学报，2014，28（05）：772-776.
[7]崔广荣，张子学，张从宇，等.文心兰NaN3离体化学诱变及RAPD检测[J].广西植物，2011，31（06）：836-843.
作者简介：王霞，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：植物分子生物学及天然产物分离。
关键词：凤尾鸡冠花；耐盐突变体；RAPD鉴定
基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究（吉教科合字〔2013〕第471号）
中图分类号： S681.3 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.048
随机扩增多态性DNA（Random amplifie dpolymorphic DNA，简称RAPD）是建立在PCR基础之上的检测DNA多态性的分子标记技术[1]，其利用PCR随机合成多态性DNA片段，检测被扩增区域内遗传特性变化，该技术的实施不依赖于种属的特异性和基因组的结构，无需制备探针，DNA用量少，分子识别率高，对环境污染小，成本低，已在分类学研究、品种鉴定、遗传作图等方面得到了广泛的应用[2-3]。目前，运用RAPD技术已经成功的发现了众多的突变型[4，5]。试验对NaN3诱变的凤尾鸡冠花耐盐突变体进行RAPD分析，进一步鉴定耐盐突变体的遗传稳定性，为凤尾鸡冠花耐盐新品系的诱变育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
材料：凤尾鸡冠花组培苗经NaN3诱变初筛获得的耐盐突变体。
主要试剂：随机引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×CTAB提取缓冲液、Tris-HCl、0.5 moloL-1 EDTA（pH 8.0）、氯仿-异戊醇（24︰1）、TE溶液、3 moloL-1 NaAC、异丙醇、乙醇、DNA分子量标准等，所有试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1基因组DNA提取及检测 参照赵曦[6]等的CTAB法，以未经处理的凤尾鸡冠花组培苗为对照，分别提取对照和初筛耐盐突变体的基因组DNA，并采用紫外风光光度计法和琼脂糖凝胶电泳法对所提基因组进行鉴定。
1.2.2凤尾鸡冠耐盐突变体的RAPD检测
1.2.2.1引物筛选及RAPD反应 从上海生工生物工程技术有限公司购进98个随机引物（10个碱基），以对照和耐盐突变体基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，筛选出突变体与对照间具多态性的特异引物。
采用20μL的RAPD反应体系，分别为：20ngoμL-1模板DNA 2.0 μL，10pm随机引物1.0 μL，2.5 mmooL-1MgCl2 2.0 μL，2.5 mmooL-1 dNTP 0.3 μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，其余由ddH2O补充。反应程序为： 94 ℃预变性5分钟；94 ℃变性1分钟，35℃退火45秒，72 ℃延伸1 分钟，42 个循环；72 ℃再延伸10分钟；4 ℃保温。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳分离和分析。
1.2.2.2RAPD标记分析 通过筛选引物，检测凤尾鸡冠花耐盐突变体相对于对照在DNA分子水平上的变化，获得突变体与对照间的多态性基因位点，以稳定而清晰的条带作为统计数据，对试验数据进行统计分析，计算变异率[7]。
2 结果与分析
2.1基因组DNA的纯度和浓度检测
采用CTAB法提取得到的DNA颜色呈无色透明状，较粘稠，易溶于TE溶液。对照和突变体DNA样品OD260/OD280都在1.80-1.92之间，OD260/OD230都在1.98～2.10之间，表明所提DNA样品中蛋白和RNA污染较少，DNA纯度较高，凝胶电泳结果如图1所示，基因组条带清晰、整齐、明亮，无弥散现象，点样孔清晰，可进行下一步实验。
2.2 引物的筛选及RAPD分析
用98个随机引物对凤尾鸡冠花耐盐突变体及其对照进行RAPD分析，结果发现有12条引物可扩增出清晰、明亮、多态性较好的条带（表1），对凤尾鸡冠花对照和初筛获得的耐盐突变体进行了RAPD分析，发现12个随机引物中，9个引物（S87，S88、S89、S97、S113、S424、S432，S435）出现差异条带，3个引物（S98、S117、S440）未出现差异性条带，其余引物均没有扩增出条带，图2为多态性最好的3个随机引物（S87、S432、S435）的扩增图。12个可扩增引物共扩增出104条带，其中对照和突变体分别扩增的总条带数为49和55，扩增片段大小在100-2000bp之间。RAPD扩增结果中出现了新增或缺失条带，与对照相比，突变体新增条带11条，缺失条带12条，凤尾鸡冠花耐盐突变体与对照差异较大，变异率为31.73%，充分说明了NaN3结合组织培养技术能有效地诱导凤尾鸡冠花基因变异。
3 讨论
RAPD是一种有效的检测基因差异的技术，该技术已经应用于体外诱变育种引起的DNA多态性分析，凤尾鸡冠花组培苗经NaN3处理后，结合植物组织培养技术，在半致死剂量的NaCl胁迫下诱变耐盐突变体，RAPD扩增结果差异显著。与对照相比，扩增带型出现了差异，这些差异带型主要有扩增条带的消失、增加以及扩增条带的强弱变化。引起扩增带消失或新增的原因肯是引物互补位点发生碱基突变，或互补位点间的DNA发生插入或缺失，或插入片段过大，这些都能导致差异片段的出现。引起扩增条带强度变化的原因可能是多拷贝引物结合位点上某些碱基发生突变，使引物结合量减少，造成DNA量减少，或是新增片段与原有某片段的分子量相近，使谱带加深，即反映出谱带深浅的变化。这些差异充分说明NaN3诱变结合体细胞无性系变异能引起遗传物质发生丰富的变异。
参考文献
[1]白玉.DNA分子标记技术及其应用[J].安徽农业科学，2007，35（24）：7422-7424.
[2]董喜存，李文建，余丽霞，等.用随机扩增多态性DNA技术对重离了辐照大丽花花色突变体的初步研究[J].辐射研究与辐射工艺学报，2007，25（01）：62-64.
[3]潘宁，赵琦，土振莲，等.矮化早熟高粱突变体的RAPD分析[J].生物技术通报，2005（02）：29-31.
[4]马升华，姚艳玲，钱丽华，等.组培获得大花蕙兰叶色突变体的RAPD分析[J].杭州农业科技，2007（03）：11-13.
[5]李明飞，谢彦周，刘录祥，等.叠氮化钠诱变普通小麦陕农33突变体库的构建和初步评估[J].麦类作物学报，2015，35（01）：22-29.
[6]赵曦，王广金，李铁，等.大豆空间诱变突变体的RAPD分析[J].核农学报，2014，28（05）：772-776.
[7]崔广荣，张子学，张从宇，等.文心兰NaN3离体化学诱变及RAPD检测[J].广西植物，2011，31（06）：836-843.
作者简介：王霞，硕士，吉林农业科技学院，讲师，研究方向：植物分子生物学及天然产物分离。