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【目的】本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）溶血素O （Listeriolysin O，LLO）的关键结构域PEST序列（包含S44、S48和T51关键磷酸化位点）突变体，并针对其生物学功能展开研究。【方法】以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因，克隆至pET30a（+）原核表达载体，在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLOΔPEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒，转入E. coli Rosetta感受态细胞中，诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性，并通过Western blot检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。【结果】结果显示，本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLOΔPEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH 5.5和7.4条件下，LLOΔPEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性，说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现，重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。【结论】研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需，且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。