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摘 要：试验利用软件设计出两条特异性引物，再通过PCR扩增，扩增猪流行性腹泻病毒S基因片段，然后将S基因片段连接到表达载体PMD18-T中，构建了重组质粒，转化大肠杆菌后，提取重组质粒，再经过双酶切鉴定和PCR鉴定，来证实提取的基因片段与预期目标一致.本实验为以后建立猪流行性腹泻快速诊断方法、基因免疫、以及猪流行性腹泻病毒基因的进一步的研究工作奠定基础。
关键词：猪流行性腹泻病毒； S基因；克隆；鉴定
PEDV具有冠状病毒科的所有形态特征。从粪便中检到的病毒粒子呈多形态，近似球形，其直径（含纤突）约95 nm～190 nm，平均130 nm，纤突长 18 nm～23 nm，规则地呈花瓣状排列。许多粒子有不透明的核心，由一半透明环与囊膜分开。
PEDV 亚基因组翻译产生3种主要的结构蛋白，分别为S纤突糖蛋白、M膜蛋白和N核衣壳蛋白[1]，其中S蛋白（180 kDa～220 kDa）突出于病毒粒子外，在受体细胞结合吸附、膜融合等方面起者重要的作用，其也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫原[2]。PEDV的S基因长为4.15×103 bp， S基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成， 而是翻译分子量 （Mr） 为151K的1 383个氨基酸的多肽， 该多肽含有29个潜在的糖基化位点，预测的PEDV S基因大多数糖基化位点都具有生物学意义[3]。PEDV 的中和抗原发现存在于S基因的1495 bp～1914 bp之间[4]。中国1976年首次报道PED的发生[5]，现在PEDV已成为引起猪场仔猪死亡的重要病原之一，而且给养猪业带来了巨大的经济损失。
随着分子生物学的发展，对其他冠状病毒基因工程苗、核酸苗的研制已有了较大的进展，而PEDV在此方面的研究比较滞后，而获得PEDV免疫基因是研制此类疫苗的前提，我国虽然有不同毒株序列的克隆，但对其特性的报道很少，故对S基因进行可克隆和蛋白特性分析，将为进一步研制PEDV基因工程苗和S蛋白的结构及功能的研究奠定基础。
1 材料
1.1毒株
PEDV DX毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病研究室分离鉴定并保存。取冻存的病猪小肠刮取肠内容物，-70 ℃保存以备用。
1.2 菌种与质粒
E. coli JM109 菌株由兰州兽医研究所传染病研究室保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）公司。
1.3 主要试剂
RNA提取试剂盒购自德国Q-Gene公司；DL2000 DNA Marker、IPTG、X-gal、氨苄青霉素、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Premix Taq 酶、dNTP、DNA凝胶纯化试剂盒及质粒小量提取试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品。
1.4 试验动物
25日龄健康仔猪，购自兰州养猪场。
1.5 仪器
PCR扩增仪（MJ Rearch，PTC-150，USA）；2K15高速台式冷冻离心机（Sigma，USA）；低温冷冻离心机（Hermler）；紫外凝胶成像仪（GeneGelius）；DYY-31A型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；高速微量离心机（Hettich）。
2 方法
2.1 病毒的增殖与收获
将冻存的肠容物2 mL投服于25日龄以内的健康小猪，当其出现发病症状或死亡以后取小肠内容物，5 000 r/min 离心，取上清于-70 ℃保存备用。
2.2 病毒RNA的提取
利用RNeasy Mini Kit 试剂盒提取总RNA。具体操作按RNeasy Mini Kit 试剂盒说明书进行。试验所用的离心管、枪头、预先经1 ‰ DEPC水处理（DEPC为焦碳酸二乙酯，Diethylpyrocarbonate），操作时应戴手套。
（1）毒液350 μL （400 μL） 5 000 r/min 离心1 min。
（2）将上清液移入1.5 mL Eppendorf管中加RLT （1 000 μL RLT 加10 μL β-ME）350 μL（400 μL）混匀，4 ℃放置10 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液。
（3）加700 μL（800 μL）70%乙醇（DEPC水配）轻混。
（4）取700 μL上述样品于Mini柱中，12 000 r/min离心15 s，弃离心液，再将剩余样品加入柱中，12 000 r/min离心30 s，弃离心液。
（5）加700 μL RW1洗液于柱中12 000 r/min离心15 s。
（6）更换离心管，加500 μL RPE洗液（提前用4倍无水乙醇配好）于MiNi柱中，12 000 r/min离心15 s。
（7）加500 μL RPE洗液于柱内，12 000 r/min离心30 s。
（8）在1.5 mL Eppendorf 管中加1.5 μL RNasin（HPR），将MiNi 柱置于管中，向柱内膜上加30 μL～50 μL RNase-free水，置30 s后，12 000 r/min离心1 min。
2.3引物的设计与合成
参照GenBank中PEDV CV777株基因序列，应用Prime 5.0软件设计用来扩增S基因的2对特异性引物（表1），由上海生工公司合成。
2.4 RT-PCR扩增
以提取的病毒RNA为模板，分别以S1和S2相应片段下游引物为反转录引物，按照常规方法合成cDNA。在0.5 mL的微量离心管中加入病毒RNA 6.0 μL 、下游引物1.0 μL，混匀，将微量离心管置于70 ℃水浴10 min，然后冰浴1 min，按顺序依次加入以下试剂： 5×AMV Buffer 5.0 μL
dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL
RNasin（50 U/μL） 1.0 μL
AMV （10U/μL） 1.0 μL
DEPC水 加至总体积到25.0 μL
将以上试剂混匀后点击离心，42 ℃反应1 h。置-20 ℃保存备用。
取3 μL cDNA、上下游引物各1 μL加入到 25 μL的Premix Taq 中，最后用灭菌去离子水将终体积调至50 μL。或在200 μL的扩增管内依次加入以下试剂：
10×PCR Buffer 5.0 μL
dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL
MCl2（25 mM） 4.0 μL
cDNA 3.0 μL
Taq 酶 1.0 μL
上下引物各1.0 μL，最后加水至50 μL。混匀后在PCR仪上进行扩增，退火温度见表2。
扩增完毕后取5 μL于10 g/L 琼脂糖凝胶电泳观察结果，并以标准DNA Marker作为分子质量参照物进行分析。
2.5 PCR产物的纯化回收
将待回收的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下所需目的片段，用DNA 片段回收试剂盒纯化目的DNA片段：
（1）使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
（2）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率（切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下）。
（3）切碎胶块。胶块切碎后，向胶块中加入融化液DR-ⅠBuffer（600 μL～700 μL），均匀混合后75 ℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45 ℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6 min～10 min）。
（4）向上述胶块融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积量的DR-Ⅱ Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20 %的异丙醇。
（5）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
（6）将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，3 600 r/min离心1 min（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1 min），弃滤液（如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA回收率）。
（7）将500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（8）将700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（9）重复操作步骤（8），12 000 r/min再离心1 min.
（10）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央加和适量的水或洗脱液（50 μL），室温静置1 min。12 000 r/min离心1 min洗脱DNA（把水或洗脱液加热至60 ℃使用时有利于提高洗脱效率）。
2.6 连接反应
按照顺序在扩增管中依次加入
pMD18-T Vector 1.0 μL
Solution I 5.0 μL
纯化回收DNA 4.0 μL
轻轻混匀，16 ℃ 1h或4 ℃过夜，取出准备转化。
2.7 感受态细胞的制备
大肠埃希氏杆菌JM109由中国农业科学院兰州兽医研究所病毒室提供。按常规方法制备感受态细胞：
（1）取大肠杆菌菌种在LB平皿上划线，37 ℃培养过夜。
（2）挑取单菌落转到含有100 mL LB的三角瓶中，于37 ℃振摇3 h（此时可取菌液加甘油于-70 ℃保存菌种）。
（3）培养物冰浴10 min或4 ℃作用1 h。
（4）将菌液移到一无菌、用冰浴冷却的50 mL离心管中，4 ℃，4 000 r/mi离心10 min。
（5）倒出培养液，将管倒置1 min，使残留的痕量培养液流尽。
（6）加入0.1 M CaCl2 20 mL 重悬沉淀（先加1 mL用枪头吹打，混匀后再加其余部分），冰浴45 min。
（7） 4 ℃，4 000 r/min离心10 min（离心完的沉淀散开呈U形较好）。
（8）弃上清，加入0.1 M CaCl2 2 mL 重悬沉淀（先加1 mL用枪头吹打混匀后，再加入剩余量）。
（9）取200 μL 分装于无菌的Eppendorf管中，封口，4 ℃过夜（12 h～14 h内效果最好，3 d～4 d也能用）或加入终浓度为150 mL/L的甘油-70 ℃保存。
2.8 转化
采用热激法进行连接产物的转化：
（1）将连接过夜的DNA质粒，吸取5 μL加入制备好的4 ℃保存备用的感受态细胞中轻混，冰浴 30 min。同时取SOC或无氨苄LB置37 ℃水浴锅。
（2）置42 ℃水浴90 s，严格控制时间，不可摇动，不振荡，然后快速移入冰水中3 min。
（3）加入37 ℃水浴预热的LB（夏天早点取出） 800 μL（无氨苄）37 ℃摇培1 h，转速220 r/min，不超过225 r/min。 （4） 4 000 r/min离心4 min。
（5）弃部分上清液，留约100 μL上清液重悬细菌。
（6）取AMPr平板，加入16 μL X-gal（50 mg/mL），4 μL IPTG（200 mg/mL），用弯玻璃棒（提前用酒精棉搽后酒精灯烘烤）均匀涂板，等稍干后倒置平板置 37 ℃温箱过夜。
2.9 质粒DNA的提取
以α-互补原理挑选在涂有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色菌落，接种于含Ampr的LB培养基中，37 ℃摇培12 h～18 h后抽提质粒。抽提质粒用质粒DNA小量纯化试剂盒进行：
（1）取1 mL～4 mL的过夜培养液，12 000 r/min离心2 min，弃上清。
（2）用250 μL的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀（注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体悬浮）。
（3）加入250 μL的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液（此步骤不宜超过5 min）。
（4）加入400 μL的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成结实的凝集块，然后室温静置2 min。
（5）室温12 000 r/min离心5 min，取上清。
（6）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
（7）将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，3 600 r/min离心1 min（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1 min），弃滤液。
（8）将500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（9）将700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（10）重复操作步骤⑨，然后，12 000 r/min再离心1 min。
（11）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入适量的水或洗脱液，室温静置1 min。
（12）12 000 r/min离心1 min洗脱DNA。
2.10 重组质粒的酶切鉴定
将提取的重组质粒DNA和空载体质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳筛选出阳性克隆。将阳性质粒DNA进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切，酶切体系为：
10×Buffer H 4.0 μL
EcoRⅠ 0.5 μL
Hind Ⅲ 0.5 μL
重组质粒 8.0 μL
水 7.0 μL
37 ℃水浴2 h，电泳观察结果。
2.11 重组质粒PCR鉴定
取鉴定阳性的质粒 DNA 1 μL作为模板，按PCR扩增条件进行PCR扩增鉴定，电泳观察结果。
2.12 组质粒的核苷酸序列测定与分析
采用Sanger’s 双脱氧末端终止法对经酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。由宝生物（大连）工程有限公司完成。根据测序结果应用DNAstar等软件对PEDV DX 株S基因核苷酸序列及相应的氨基酸序列与Genbank、EMBL和DDBJ中PEDV 其他毒株进行同源性比较并绘制进化树，利用Protein Prediction在线软件对PEDV DX株S蛋白进行功能位点的分析，利用SOSUI在线软件对其进行跨膜分析，利用DNAstar Protein 不同方法对其进行二级结构和B淋巴细胞抗原表位的预测。
3 结果
3.1 PEDV DX S基因的RT-PCR扩增
分别用S基因的两对引物进行RT-PCR扩增，分别扩增出了大小约为2 10 6bp和2 182 bp片段，与预期片段的大小相符（图1）
3.2 PCR产物的克隆与鉴定
3.2.1 重组质粒的鉴定
将提取的重组质粒与空载体DNA质粒进行电泳比较，选取阳性质粒。
3.2.2 重组质粒的PCR鉴定
以阳性质粒DNA作为模板进行PCR，扩增出预期大小的片段（图2）。
3.2.3 重组质粒的酶切鉴定
将阳性质粒进行双酶切，产生了与空载体和目的片段（S2目的片段中有酶切位点将其切成两段）大小相符的酶切片段（图3）。
3.3 核苷酸序列的测定
阳性克隆测序结果经BLAST分析表明为TGEV的S基因序列，其片段大小为4 152 bp。
4 讨论
猪流行性腹泻（PEDV）是20世纪70年代在比利时、荷兰、捷克、英国、匈牙利等欧洲国家新发现的猪的一种肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。由于PED与猪传染性胃肠炎（TGE）十分相似，直到1977年从病料中分离到致病因子类冠状病毒，才确认这是一种独立的疾病，并建议称作流行性腹泻病毒[6]。1971年，在我国上海地区也发生了以新生仔猪高死亡率，各种不同年龄品种剧烈腹泻为特征的传染病，用各类抗生素和各种中西药物治疗都无济于事，称作疑似传染性胃肠炎。1980年，用组织化学酶标技术证实此流行性泻病毒实质为PED。PED在世界上分布很广。我国发生的所谓TGE，证实很多属于PED，对本病的研究也取得了重大进展[7]。
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种以呕吐、腹泻和脱水等为主要特征的急性肠道传染病。自发现本病以来，其传播范围极广，而且发病率、死亡率居高不下，已成为全球危害最为严重的病毒性腹泻病之一[8]。
本毒株是采在甘肃本地，对PEDV不同毒株克隆分析发现，不同毒株S基因的大小略有不同。英国株CV777和Br1/87、中国株JS-2004-2以及韩国株Chinju99 S 基因均为4152个碱基[9]，而韩国毒株登陆号为AF500215、AF237764两株S基因为4 161个碱基[10]。实验表明PEDV DX株S 基因为4 152个碱基，推导氨基酸1 383个，编码一个151611D的蛋白。同英国株CV777相比，在中和抗原区域DX株10个氨基酸发生了变异，分别是517位A-S，521位L-H，523位S-G，527位V-I，549位T-S，594位G-S，605位A-G，608位S-G，612位L-F，635位I-V。□□
参考文献：（10篇，略）
关键词：猪流行性腹泻病毒； S基因；克隆；鉴定
PEDV具有冠状病毒科的所有形态特征。从粪便中检到的病毒粒子呈多形态，近似球形，其直径（含纤突）约95 nm～190 nm，平均130 nm，纤突长 18 nm～23 nm，规则地呈花瓣状排列。许多粒子有不透明的核心，由一半透明环与囊膜分开。
PEDV 亚基因组翻译产生3种主要的结构蛋白，分别为S纤突糖蛋白、M膜蛋白和N核衣壳蛋白[1]，其中S蛋白（180 kDa～220 kDa）突出于病毒粒子外，在受体细胞结合吸附、膜融合等方面起者重要的作用，其也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫原[2]。PEDV的S基因长为4.15×103 bp， S基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成， 而是翻译分子量 （Mr） 为151K的1 383个氨基酸的多肽， 该多肽含有29个潜在的糖基化位点，预测的PEDV S基因大多数糖基化位点都具有生物学意义[3]。PEDV 的中和抗原发现存在于S基因的1495 bp～1914 bp之间[4]。中国1976年首次报道PED的发生[5]，现在PEDV已成为引起猪场仔猪死亡的重要病原之一，而且给养猪业带来了巨大的经济损失。
随着分子生物学的发展，对其他冠状病毒基因工程苗、核酸苗的研制已有了较大的进展，而PEDV在此方面的研究比较滞后，而获得PEDV免疫基因是研制此类疫苗的前提，我国虽然有不同毒株序列的克隆，但对其特性的报道很少，故对S基因进行可克隆和蛋白特性分析，将为进一步研制PEDV基因工程苗和S蛋白的结构及功能的研究奠定基础。
1 材料
1.1毒株
PEDV DX毒株由中国农业科学院兰州兽医研究所传染病研究室分离鉴定并保存。取冻存的病猪小肠刮取肠内容物，-70 ℃保存以备用。
1.2 菌种与质粒
E. coli JM109 菌株由兰州兽医研究所传染病研究室保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）公司。
1.3 主要试剂
RNA提取试剂盒购自德国Q-Gene公司；DL2000 DNA Marker、IPTG、X-gal、氨苄青霉素、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Premix Taq 酶、dNTP、DNA凝胶纯化试剂盒及质粒小量提取试剂盒均为宝生物工程（大连）有限公司产品。
1.4 试验动物
25日龄健康仔猪，购自兰州养猪场。
1.5 仪器
PCR扩增仪（MJ Rearch，PTC-150，USA）；2K15高速台式冷冻离心机（Sigma，USA）；低温冷冻离心机（Hermler）；紫外凝胶成像仪（GeneGelius）；DYY-31A型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；高速微量离心机（Hettich）。
2 方法
2.1 病毒的增殖与收获
将冻存的肠容物2 mL投服于25日龄以内的健康小猪，当其出现发病症状或死亡以后取小肠内容物，5 000 r/min 离心，取上清于-70 ℃保存备用。
2.2 病毒RNA的提取
利用RNeasy Mini Kit 试剂盒提取总RNA。具体操作按RNeasy Mini Kit 试剂盒说明书进行。试验所用的离心管、枪头、预先经1 ‰ DEPC水处理（DEPC为焦碳酸二乙酯，Diethylpyrocarbonate），操作时应戴手套。
（1）毒液350 μL （400 μL） 5 000 r/min 离心1 min。
（2）将上清液移入1.5 mL Eppendorf管中加RLT （1 000 μL RLT 加10 μL β-ME）350 μL（400 μL）混匀，4 ℃放置10 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液。
（3）加700 μL（800 μL）70%乙醇（DEPC水配）轻混。
（4）取700 μL上述样品于Mini柱中，12 000 r/min离心15 s，弃离心液，再将剩余样品加入柱中，12 000 r/min离心30 s，弃离心液。
（5）加700 μL RW1洗液于柱中12 000 r/min离心15 s。
（6）更换离心管，加500 μL RPE洗液（提前用4倍无水乙醇配好）于MiNi柱中，12 000 r/min离心15 s。
（7）加500 μL RPE洗液于柱内，12 000 r/min离心30 s。
（8）在1.5 mL Eppendorf 管中加1.5 μL RNasin（HPR），将MiNi 柱置于管中，向柱内膜上加30 μL～50 μL RNase-free水，置30 s后，12 000 r/min离心1 min。
2.3引物的设计与合成
参照GenBank中PEDV CV777株基因序列，应用Prime 5.0软件设计用来扩增S基因的2对特异性引物（表1），由上海生工公司合成。
2.4 RT-PCR扩增
以提取的病毒RNA为模板，分别以S1和S2相应片段下游引物为反转录引物，按照常规方法合成cDNA。在0.5 mL的微量离心管中加入病毒RNA 6.0 μL 、下游引物1.0 μL，混匀，将微量离心管置于70 ℃水浴10 min，然后冰浴1 min，按顺序依次加入以下试剂： 5×AMV Buffer 5.0 μL
dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL
RNasin（50 U/μL） 1.0 μL
AMV （10U/μL） 1.0 μL
DEPC水 加至总体积到25.0 μL
将以上试剂混匀后点击离心，42 ℃反应1 h。置-20 ℃保存备用。
取3 μL cDNA、上下游引物各1 μL加入到 25 μL的Premix Taq 中，最后用灭菌去离子水将终体积调至50 μL。或在200 μL的扩增管内依次加入以下试剂：
10×PCR Buffer 5.0 μL
dNTP Mix（2.5 mM） 4.0 μL
MCl2（25 mM） 4.0 μL
cDNA 3.0 μL
Taq 酶 1.0 μL
上下引物各1.0 μL，最后加水至50 μL。混匀后在PCR仪上进行扩增，退火温度见表2。
扩增完毕后取5 μL于10 g/L 琼脂糖凝胶电泳观察结果，并以标准DNA Marker作为分子质量参照物进行分析。
2.5 PCR产物的纯化回收
将待回收的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下所需目的片段，用DNA 片段回收试剂盒纯化目的DNA片段：
（1）使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
（2）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率（切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下）。
（3）切碎胶块。胶块切碎后，向胶块中加入融化液DR-ⅠBuffer（600 μL～700 μL），均匀混合后75 ℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45 ℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6 min～10 min）。
（4）向上述胶块融化液中加入DR-ⅠBuffer量的1/2体积量的DR-Ⅱ Buffer，均匀混合。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20 %的异丙醇。
（5）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
（6）将上述操作步骤4的溶液转移至Spin Column中，3 600 r/min离心1 min（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1 min），弃滤液（如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA回收率）。
（7）将500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（8）将700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（9）重复操作步骤（8），12 000 r/min再离心1 min.
（10）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央加和适量的水或洗脱液（50 μL），室温静置1 min。12 000 r/min离心1 min洗脱DNA（把水或洗脱液加热至60 ℃使用时有利于提高洗脱效率）。
2.6 连接反应
按照顺序在扩增管中依次加入
pMD18-T Vector 1.0 μL
Solution I 5.0 μL
纯化回收DNA 4.0 μL
轻轻混匀，16 ℃ 1h或4 ℃过夜，取出准备转化。
2.7 感受态细胞的制备
大肠埃希氏杆菌JM109由中国农业科学院兰州兽医研究所病毒室提供。按常规方法制备感受态细胞：
（1）取大肠杆菌菌种在LB平皿上划线，37 ℃培养过夜。
（2）挑取单菌落转到含有100 mL LB的三角瓶中，于37 ℃振摇3 h（此时可取菌液加甘油于-70 ℃保存菌种）。
（3）培养物冰浴10 min或4 ℃作用1 h。
（4）将菌液移到一无菌、用冰浴冷却的50 mL离心管中，4 ℃，4 000 r/mi离心10 min。
（5）倒出培养液，将管倒置1 min，使残留的痕量培养液流尽。
（6）加入0.1 M CaCl2 20 mL 重悬沉淀（先加1 mL用枪头吹打，混匀后再加其余部分），冰浴45 min。
（7） 4 ℃，4 000 r/min离心10 min（离心完的沉淀散开呈U形较好）。
（8）弃上清，加入0.1 M CaCl2 2 mL 重悬沉淀（先加1 mL用枪头吹打混匀后，再加入剩余量）。
（9）取200 μL 分装于无菌的Eppendorf管中，封口，4 ℃过夜（12 h～14 h内效果最好，3 d～4 d也能用）或加入终浓度为150 mL/L的甘油-70 ℃保存。
2.8 转化
采用热激法进行连接产物的转化：
（1）将连接过夜的DNA质粒，吸取5 μL加入制备好的4 ℃保存备用的感受态细胞中轻混，冰浴 30 min。同时取SOC或无氨苄LB置37 ℃水浴锅。
（2）置42 ℃水浴90 s，严格控制时间，不可摇动，不振荡，然后快速移入冰水中3 min。
（3）加入37 ℃水浴预热的LB（夏天早点取出） 800 μL（无氨苄）37 ℃摇培1 h，转速220 r/min，不超过225 r/min。 （4） 4 000 r/min离心4 min。
（5）弃部分上清液，留约100 μL上清液重悬细菌。
（6）取AMPr平板，加入16 μL X-gal（50 mg/mL），4 μL IPTG（200 mg/mL），用弯玻璃棒（提前用酒精棉搽后酒精灯烘烤）均匀涂板，等稍干后倒置平板置 37 ℃温箱过夜。
2.9 质粒DNA的提取
以α-互补原理挑选在涂有X-gal和IPTG的LB琼脂平板上挑选白色菌落，接种于含Ampr的LB培养基中，37 ℃摇培12 h～18 h后抽提质粒。抽提质粒用质粒DNA小量纯化试剂盒进行：
（1）取1 mL～4 mL的过夜培养液，12 000 r/min离心2 min，弃上清。
（2）用250 μL的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀（注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体悬浮）。
（3）加入250 μL的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液（此步骤不宜超过5 min）。
（4）加入400 μL的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成结实的凝集块，然后室温静置2 min。
（5）室温12 000 r/min离心5 min，取上清。
（6）将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
（7）将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，3 600 r/min离心1 min（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1 min），弃滤液。
（8）将500 μL的Rinse A加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（9）将700 μL的Rinse B加入Spin Column中， 3 600 r/min离心30 s，弃滤液。
（10）重复操作步骤⑨，然后，12 000 r/min再离心1 min。
（11）将Spin Column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入适量的水或洗脱液，室温静置1 min。
（12）12 000 r/min离心1 min洗脱DNA。
2.10 重组质粒的酶切鉴定
将提取的重组质粒DNA和空载体质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳筛选出阳性克隆。将阳性质粒DNA进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ 双酶切，酶切体系为：
10×Buffer H 4.0 μL
EcoRⅠ 0.5 μL
Hind Ⅲ 0.5 μL
重组质粒 8.0 μL
水 7.0 μL
37 ℃水浴2 h，电泳观察结果。
2.11 重组质粒PCR鉴定
取鉴定阳性的质粒 DNA 1 μL作为模板，按PCR扩增条件进行PCR扩增鉴定，电泳观察结果。
2.12 组质粒的核苷酸序列测定与分析
采用Sanger’s 双脱氧末端终止法对经酶切和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。由宝生物（大连）工程有限公司完成。根据测序结果应用DNAstar等软件对PEDV DX 株S基因核苷酸序列及相应的氨基酸序列与Genbank、EMBL和DDBJ中PEDV 其他毒株进行同源性比较并绘制进化树，利用Protein Prediction在线软件对PEDV DX株S蛋白进行功能位点的分析，利用SOSUI在线软件对其进行跨膜分析，利用DNAstar Protein 不同方法对其进行二级结构和B淋巴细胞抗原表位的预测。
3 结果
3.1 PEDV DX S基因的RT-PCR扩增
分别用S基因的两对引物进行RT-PCR扩增，分别扩增出了大小约为2 10 6bp和2 182 bp片段，与预期片段的大小相符（图1）
3.2 PCR产物的克隆与鉴定
3.2.1 重组质粒的鉴定
将提取的重组质粒与空载体DNA质粒进行电泳比较，选取阳性质粒。
3.2.2 重组质粒的PCR鉴定
以阳性质粒DNA作为模板进行PCR，扩增出预期大小的片段（图2）。
3.2.3 重组质粒的酶切鉴定
将阳性质粒进行双酶切，产生了与空载体和目的片段（S2目的片段中有酶切位点将其切成两段）大小相符的酶切片段（图3）。
3.3 核苷酸序列的测定
阳性克隆测序结果经BLAST分析表明为TGEV的S基因序列，其片段大小为4 152 bp。
4 讨论
猪流行性腹泻（PEDV）是20世纪70年代在比利时、荷兰、捷克、英国、匈牙利等欧洲国家新发现的猪的一种肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。由于PED与猪传染性胃肠炎（TGE）十分相似，直到1977年从病料中分离到致病因子类冠状病毒，才确认这是一种独立的疾病，并建议称作流行性腹泻病毒[6]。1971年，在我国上海地区也发生了以新生仔猪高死亡率，各种不同年龄品种剧烈腹泻为特征的传染病，用各类抗生素和各种中西药物治疗都无济于事，称作疑似传染性胃肠炎。1980年，用组织化学酶标技术证实此流行性泻病毒实质为PED。PED在世界上分布很广。我国发生的所谓TGE，证实很多属于PED，对本病的研究也取得了重大进展[7]。
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种以呕吐、腹泻和脱水等为主要特征的急性肠道传染病。自发现本病以来，其传播范围极广，而且发病率、死亡率居高不下，已成为全球危害最为严重的病毒性腹泻病之一[8]。
本毒株是采在甘肃本地，对PEDV不同毒株克隆分析发现，不同毒株S基因的大小略有不同。英国株CV777和Br1/87、中国株JS-2004-2以及韩国株Chinju99 S 基因均为4152个碱基[9]，而韩国毒株登陆号为AF500215、AF237764两株S基因为4 161个碱基[10]。实验表明PEDV DX株S 基因为4 152个碱基，推导氨基酸1 383个，编码一个151611D的蛋白。同英国株CV777相比，在中和抗原区域DX株10个氨基酸发生了变异，分别是517位A-S，521位L-H，523位S-G，527位V-I，549位T-S，594位G-S，605位A-G，608位S-G，612位L-F，635位I-V。□□
参考文献：（10篇，略）