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[摘要]发酵是生物类学科中一项重要的实验，而发酵过程中微生物量的变化的监测是整个发酵过程中影响最大和最重要的环节，研究发酵过程必然要对生物量的变化进行精确的监测。本文尝试论述集中在发酵过程中检测生物量的方法。
[关键词]发酵过程生物量检测研究
中图分类号：TQ92 文献标识码：TQ 文章编号：1009―914X（2013）31―0295―01
微生物发酵即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。发酵是一种比较常见的化学反应，广泛运用在生物、食品、化学等工业。从定义上可以看出，在发酵过程中生物量（主要是指微生物量）会不断的发生变化，因而研究发酵必须对这些生物量进行精确的监测。
一、发酵过程和生物量的关系
要研究发酵过程中生物量的监测方法，了解发酵的特点是必要的，总的来说，工业发酵过程具有以下几个特点：
（一）工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式：有氧呼吸、无氧呼吸和发酵。
（二）发酵原料一般以淀粉、糖蜜或者其他农副产品为主。发酵规模可达几十甚至上百吨。
（三）工业发酵过程是通过生物体的自动调节或者应激方式来完成的，反应的目的一般是得到某种特定的物质，发酵过程调节是为了使这种物质的积累，以得到产品。
（四）一般制种过程和发酵过程分为两部分，并不在一个反应器中。由于工业级的生产过程控制属于固定的模式，菌量的控制直接关系到后续的发酵条件，所以制种菌量必须合理的进行控制。
（五）微生物的初始生长一般为指数生长模式。实时的菌量监测对发酵意义重大。未及时检测可能使菌体数量发生倍数变化，对后续的营养物质的需求变得苛刻，导致次级代谢产物的大量产生，同时亦可能产生对菌体反馈抑制，影响到生产。
二、发酵过程中常见的生物量检测方法
在生命科学领域和工业实用领域，发酵过程中生物量的监测方法有很多，这种方法中，大部分过于专业化并且实用价值较小。通过比对和谨慎考虑，本文尝试论述四种生物量检测方法，这四种方法都是比较常见和具有较强的实用性。介绍过之后，本文尝试给出一种最具科学性的方法。
（一）直接计数测定法。该方法是指通过显微镜等科学观测仪器，在分辨微生物种类的前提下，用血球计数板和细菌计数板进行直接的数量监测，或者尝试使用电子计数器进行技术。这是一种简便易于操作的检测方法，它的检测结果直观生动。但在这其中存在着许多问题。首先，发酵过程中参与化学反应的微生物数量数以亿计，虽然有血球计数板和细菌计数板的帮助，但工作量还是非常巨大；同时由于微生物数量太多，而且由于是对整个过程中微生物量变化的检测，所以很容易出现偏差，而一旦出现检测计数方面的错误，整个发酵过程的检测就是没有意义的。所以总的来说，直接技术检测法操作简单但是容易出现错误，只适用于周期短、规模小的发酵过程。
（二）比浊法。比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。他的定义是悬浮颗粒在液体中造成透射光的减弱，减弱的程度与悬浮颗粒的量相关，据此可定量测定物质在溶液中呈悬浮状态时浓度的方法。也就是根据菌悬液的浓度在一定范围内与光密度成正比，可以用分光光度计测OD值，用OD值表示样品菌液浓度。与第一种方法想比较，比浊法操作更加简单，而且错误发生的几率更低。但其范围较大，容错率比较高。工业化应用必须进行相应的方法进行开发。可以参照下图流程：
（三）核算计数法——荧光定量PCR技术的应用。荧光定量PCR技术是与普通的PCR技术不尽相同的，在发酵过程中的用用是用荧光探针和荧光染料标记核算，通过PCR统计技术来完成核算数量变动来完成一个变量的指数曲线，一次来完成对核算数量变化的检测。荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。在这里，有两种最常用的方法，即非特异性SYBR Green I染料法和特异性Taqman水解探针法。
1.非特异性SYBR Green I染料法。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
2.特异性Taqman水解探针法。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。
（四）活菌计数法、MPN和平板计数法。这是三种不同的方法，但在发酵中生物量检测中常常结合使用，所以本文当做一种方法研究。
1.活菌计数法。此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落，这种方法可以测出微量的菌数，非常实用和有效。这种方法也有确定，一旦在操作过程中造成污染或者细胞损伤等原因会造成结果的不稳定，但这多是由于操作不当引起的，而操作不当是很容易避免的，同时这种方法对测量微量的菌数上非常的有效和使用，所以这是一种非常常见好用的生物量检测方法。
2.MPN计数法。MPN计数法又被称为最大可能数法。这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。这种方法广泛运用在大肠菌群，大肠杆菌等的检测，在发酵过程中也十分有效，应用最为广泛。工作原理是因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可按概率理论计算菌数。如果每份接种样的细菌数平均值为Vl，每个接种管中进入k（k＝0、1、2……）个菌的概率Pn接近于泊松分布。由此看来，MNP计数法是一种间接计数法。
3.平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
三、四种检测方法比对结论
在上文中我们介绍了四种大方面上来说的在发酵过程中生物量检测的常用方法，通过简单介绍我们可以发现，直接计数测量法虽然较为简单，但操作量大，计数方法繁琐；比浊法较为简便，限制较多，但在实时检测时得出结论比较迅速及时，适合用于大工业的生产控制。核酸计数法——荧光定量PCR技术和活菌计数法、MPN和平板计数法最为常用，操作过程和检测方法较为科学。
结语：
在本文中，我们论述了工业发酵的一些特点以及在其过程中的生物量检测的若干种方法。通过深入的研究探索我们得出这样一个结论：在发酵过程中生物测量最为科学的方法是核酸计数法——荧光定量PCR技术和活菌计数法、MPN和平板计数法，但在大工业的生产中，比浊法检测迅速，设备投入较少，操作方法简易，经过合理方法开发后仍不失为一个较为有效的方法。
[关键词]发酵过程生物量检测研究
中图分类号：TQ92 文献标识码：TQ 文章编号：1009―914X（2013）31―0295―01
微生物发酵即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。发酵是一种比较常见的化学反应，广泛运用在生物、食品、化学等工业。从定义上可以看出，在发酵过程中生物量（主要是指微生物量）会不断的发生变化，因而研究发酵必须对这些生物量进行精确的监测。
一、发酵过程和生物量的关系
要研究发酵过程中生物量的监测方法，了解发酵的特点是必要的，总的来说，工业发酵过程具有以下几个特点：
（一）工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式：有氧呼吸、无氧呼吸和发酵。
（二）发酵原料一般以淀粉、糖蜜或者其他农副产品为主。发酵规模可达几十甚至上百吨。
（三）工业发酵过程是通过生物体的自动调节或者应激方式来完成的，反应的目的一般是得到某种特定的物质，发酵过程调节是为了使这种物质的积累，以得到产品。
（四）一般制种过程和发酵过程分为两部分，并不在一个反应器中。由于工业级的生产过程控制属于固定的模式，菌量的控制直接关系到后续的发酵条件，所以制种菌量必须合理的进行控制。
（五）微生物的初始生长一般为指数生长模式。实时的菌量监测对发酵意义重大。未及时检测可能使菌体数量发生倍数变化，对后续的营养物质的需求变得苛刻，导致次级代谢产物的大量产生，同时亦可能产生对菌体反馈抑制，影响到生产。
二、发酵过程中常见的生物量检测方法
在生命科学领域和工业实用领域，发酵过程中生物量的监测方法有很多，这种方法中，大部分过于专业化并且实用价值较小。通过比对和谨慎考虑，本文尝试论述四种生物量检测方法，这四种方法都是比较常见和具有较强的实用性。介绍过之后，本文尝试给出一种最具科学性的方法。
（一）直接计数测定法。该方法是指通过显微镜等科学观测仪器，在分辨微生物种类的前提下，用血球计数板和细菌计数板进行直接的数量监测，或者尝试使用电子计数器进行技术。这是一种简便易于操作的检测方法，它的检测结果直观生动。但在这其中存在着许多问题。首先，发酵过程中参与化学反应的微生物数量数以亿计，虽然有血球计数板和细菌计数板的帮助，但工作量还是非常巨大；同时由于微生物数量太多，而且由于是对整个过程中微生物量变化的检测，所以很容易出现偏差，而一旦出现检测计数方面的错误，整个发酵过程的检测就是没有意义的。所以总的来说，直接技术检测法操作简单但是容易出现错误，只适用于周期短、规模小的发酵过程。
（二）比浊法。比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。他的定义是悬浮颗粒在液体中造成透射光的减弱，减弱的程度与悬浮颗粒的量相关，据此可定量测定物质在溶液中呈悬浮状态时浓度的方法。也就是根据菌悬液的浓度在一定范围内与光密度成正比，可以用分光光度计测OD值，用OD值表示样品菌液浓度。与第一种方法想比较，比浊法操作更加简单，而且错误发生的几率更低。但其范围较大，容错率比较高。工业化应用必须进行相应的方法进行开发。可以参照下图流程：
（三）核算计数法——荧光定量PCR技术的应用。荧光定量PCR技术是与普通的PCR技术不尽相同的，在发酵过程中的用用是用荧光探针和荧光染料标记核算，通过PCR统计技术来完成核算数量变动来完成一个变量的指数曲线，一次来完成对核算数量变化的检测。荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。在这里，有两种最常用的方法，即非特异性SYBR Green I染料法和特异性Taqman水解探针法。
1.非特异性SYBR Green I染料法。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
2.特异性Taqman水解探针法。Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量。
（四）活菌计数法、MPN和平板计数法。这是三种不同的方法，但在发酵中生物量检测中常常结合使用，所以本文当做一种方法研究。
1.活菌计数法。此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落，这种方法可以测出微量的菌数，非常实用和有效。这种方法也有确定，一旦在操作过程中造成污染或者细胞损伤等原因会造成结果的不稳定，但这多是由于操作不当引起的，而操作不当是很容易避免的，同时这种方法对测量微量的菌数上非常的有效和使用，所以这是一种非常常见好用的生物量检测方法。
2.MPN计数法。MPN计数法又被称为最大可能数法。这是一种应用概率理论来估算细菌浓度的方法。这种方法广泛运用在大肠菌群，大肠杆菌等的检测，在发酵过程中也十分有效，应用最为广泛。工作原理是因为细菌在样本内的分布是随机的，所以检测细菌时，可按概率理论计算菌数。如果每份接种样的细菌数平均值为Vl，每个接种管中进入k（k＝0、1、2……）个菌的概率Pn接近于泊松分布。由此看来，MNP计数法是一种间接计数法。
3.平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
三、四种检测方法比对结论
在上文中我们介绍了四种大方面上来说的在发酵过程中生物量检测的常用方法，通过简单介绍我们可以发现，直接计数测量法虽然较为简单，但操作量大，计数方法繁琐；比浊法较为简便，限制较多，但在实时检测时得出结论比较迅速及时，适合用于大工业的生产控制。核酸计数法——荧光定量PCR技术和活菌计数法、MPN和平板计数法最为常用，操作过程和检测方法较为科学。
结语：
在本文中，我们论述了工业发酵的一些特点以及在其过程中的生物量检测的若干种方法。通过深入的研究探索我们得出这样一个结论：在发酵过程中生物测量最为科学的方法是核酸计数法——荧光定量PCR技术和活菌计数法、MPN和平板计数法，但在大工业的生产中，比浊法检测迅速，设备投入较少，操作方法简易，经过合理方法开发后仍不失为一个较为有效的方法。