【摘 要】
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文中旨在利用猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白生物素化纳米抗体建立一种阻断酶联免疫吸附试验(Blocking enzyme-linked immunosorbent assay,bELISA)方法,用于检测猪体内PEDV抗体水平及疫苗免疫效果的评估.对PEDV S1蛋白的特异性单域抗体(Single-domain antibodies,sdAb) sdAb3基因进行扩增,并在3\'端融合Avitag序列,构建至原核表达载体pET21b,
【机 构】
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西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;渭南市动物疫病预防控制中心,陕西渭南 714000
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文中旨在利用猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1蛋白生物素化纳米抗体建立一种阻断酶联免疫吸附试验(Blocking enzyme-linked immunosorbent assay,bELISA)方法,用于检测猪体内PEDV抗体水平及疫苗免疫效果的评估.对PEDV S1蛋白的特异性单域抗体(Single-domain antibodies,sdAb) sdAb3基因进行扩增,并在3\'端融合Avitag序列,构建至原核表达载体pET21b,进行sdAb3-Avitag蛋白诱导表达纯化.对纯化的sdAb3-Avitag融合蛋白进行生物素标记并鉴定其活性.以PEDV重组S1蛋白为抗原,通过对各反应条件进行摸索与优化,建立一种可靠灵敏的bELISA方法应用于血清样品检测,并与商品化试剂盒检测进行比价.成功构建重组载体pET21 b-sdAb3-Avitag并诱导表达出sdAb3-Avitag蛋白.体外生物素标记的sdAb3 (sdAb3-Biotin)具有良好的活性.所构建的bELISA方法中,最适参数为:S1蛋白的包被浓度200 ng/孔;血清稀释比例1∶2,血清孵育时间2 h;sdAb3-Biotin稀释比1∶8000,孵育时间30 min;酶标抗体稀释比例1∶5000,反应时间30 min.所建立的方法与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等主要猪源病毒的阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性.利用建立的bELISA方法对临床54份猪血清样品进行检测,结果显示,该方法与商品化试剂盒检测结果具有92.56％的总体符合率.文中建立了一种省时可靠的bELISA方法,可用于PEDV的临床监测和疫苗免疫效果评估.
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