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摘要：首次应用扫描电镜技术对冠状冠环线虫（Coronocyclus coronatus）、大唇片冠环线虫（C. labiatus）和小唇片冠环线虫（C. labratus）的体表结构特征进行观察和比较。结果表明，3种线虫的形态特征存在明显差异。冠状冠环线虫外叶冠由22个小叶组成；4个亚中乳突起自口领基部，向口领顶部延伸呈隆起状；雄虫生殖锥背唇上有1对卵圆形结构的附属物，中部相融合，上面分布着许多刚毛状突起；雌虫尾部直。大唇片冠环线虫外叶冠小叶19个；口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个大的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突；雄虫生殖锥背唇上约分布着10个大小不等的圆锥形附属物；雌虫尾部稍弯向背侧。小唇片冠环线虫外叶冠小叶18个；口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个小的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突；雄虫生殖锥背唇上有1个两端呈卵圆的月牙形附属物；雌虫尾部直。
关键词：冠状冠环线虫；大唇片冠环线虫；小唇片冠环线虫；体表结构；扫描电镜
中图分类号：Q959.17；S432.4 5 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0214-04
冠环属（Coronocyclus）线虫隶属于圆线目（Strongylida）圆线科（Strongylidae）盅口亚科（Cyathostominae），是马属动物肠道内感染率较高的寄生圆线虫，往往造成宿主消瘦、贫血甚至死亡[1-5]。1986年，德国学者Hartwich对盅口族（Cyathostominea）线虫进行了分类修订，根据角质支环与口囊壁前端完全分开这一特征建立了一个新属——冠环属（Coronocyclus），并将盅口属（Cyathostomum）的4个种移入该属，即冠状冠环线虫（C. coronatus）、大唇片冠环线虫（C. labiatus）、小唇片冠环线虫（C. labratus）和箭状冠环线虫（C. sagittatus）[6]。随后，Dvojnos等又发现了一个新种，命名为尤氏冠环线虫（C. ulambajari）[7]。近几年来，笔者对河南省驴肠道寄生线虫的感染情况进行了调查，仅采集到冠状冠环线虫、大唇片冠环线虫和小唇片冠環线虫3种冠环线虫。尽管国内外学者在光镜下已经对这3种线虫作了详细的描述[8-10]，但是尚未见扫描电镜的相关报道。由于扫描电镜技术可以更直观、更清晰地观察到线虫的体表结构特征，因此被广泛应用于线虫的分类鉴定[11-14]。本研究首次应用扫描电镜技术对冠环属3种线虫的体表特征进行观察和比较，不仅可以为线虫的分类鉴定提供更多、更具体的形态学依据，同时还可以为马属动物线虫病的诊断和防治提供参考依据。
1 材料与方法
采自河南省驴肠道内的线虫标本经过处理后，固定保存于70%乙醇中。固定标本先用乳酸苯酚溶液（2份甘油、1份苯酚饱和溶液、1份乳酸、1份水）透明，然后在光学显微镜下进行形态学初步鉴定，种类鉴定主要采用张路平等提出的分类系统标准[8-9，15]。标本保存于河南师范大学生命科学学院。
挑选冠环属3种线虫雌雄虫体各5头，用于扫描电镜观察。先用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值 7.2）充分漂洗干净，再用2.5%戊二醛固定3 h，经磷酸缓冲液漂洗后，放入1%锇酸固定1.5 h，再经磷酸缓冲液漂洗，各级乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，喷金镀膜后，在S-570扫描电镜下观察和拍照（工作电压15 kV）。
2 结果与分析
2.1 冠状冠环线虫
口领显著，头部顶面观呈圆形。4个亚中乳突起自口领基部向顶部延伸呈隆起状，到达口领顶部后，突出口领之上呈子弹形（图1-1、图1-2、图1-3），乳突长9.7～11.8 μm（10.9 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图1-4）。口孔较大，近似圆形，直径为39.4～41.3 μm（40.2 μm）。口孔周围环绕着1圈外叶冠，由22个小叶组成，小叶长18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部宽3.4～4.6 μm（4.1 μm），小叶末端钝圆，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领表面（图1-2、图1-3）。
雄虫（n=5）：体长7.45～8.51 mm（7.92 mm），最大体宽341.3～392.5 μm（370.2 μm）。尾部具有发达的交合伞，由1个较长的背叶和2个卵圆形的侧叶组成，背叶和侧叶分界明显（图1-5、图1-6）。生殖锥短，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上有1对卵圆形结构的附属物，中部相融合，上面分布着许多刚毛状突起（图1-7）。
雌虫（n=5）：体长8.90～10.09 mm（10.01 mm），最大体宽372.4～453.2 μm（411.7 μm）。尾部直，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图1-8、图1-9）。阴门距肛门110.2～120.4 μm（116.3 μm），肛门距尾端174.2～194.1 μm（183.5 μm）。
2.2 大唇片冠环线虫
口领显著， 头部顶面观呈圆形。口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个大的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突，亚中乳突的大部分与唇片结合在一起，只有顶部游离在唇片的外面（图2-1、图2-2、图2-3），乳突长6.1～7.2 μm（6.8 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图2-3）。口孔较大，近似圆形，直径41.5～46.8 μm（44.3 μm）。口孔周围环绕着1外叶冠，由19个小叶组成，小叶长26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部宽4.2～5.3 μm（4.7 μm），小叶末端钝圆，向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领的表面（图2-3、图2-4）。 雄虫（n=5）：体长7.65～8.19 mm（7.94 mm），最大体宽312.6～428.3 μm（364.7 μm）。尾部具有发达的交合伞，背叶较宽阔，稍长于侧叶，背叶和侧叶分界不明显（图2-5、图2-6）。生殖锥短，卵圆形，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上分布着约10个大小不等的圆锥形附属物（图2-7）。
雌虫（n=5）：体长9.76～11.23 mm（10.54 mm），最大体宽413.6～542.3 μm（486.7 μm）。尾部粗壮，稍弯向背侧，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图2-8、图2-9）。阴门距肛门105.3～116.4 μm（112.1 μm），肛门距尾端131.7～162.5 μm（143.9 μm）。
2.3 小唇片冠环线虫
口领显著，头部顶面观呈圆形。口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个小的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突，亚中乳突仅基部与唇片结合在一起，其他大部分游离在唇片的外面（图3-1、图3-2、图3-3），乳突长5.9～6.8 μm（6.3 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图3-2）。口孔稍小，近似圆形，直径为32.6～35.5 μm（34.7 μm）。口孔周围环绕着1圈外叶冠，由18个小叶组成，小叶长11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部宽2.4～4.3 μm（3.5 μm），小叶末端钝圆，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领表面（图3-1、图3-2）。
雄虫（n=5）：体长5.67～6.78 mm（6.54 mm），最大体宽238.4～297.1 μm（254.8 μm）。尾部具有发达的交合伞，由1个稍长的背叶和2个卵圆形的侧叶组成，背叶和侧叶分界明显（图3-4、图3-5）。生殖锥短小，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上有1个月牙状的附属物，两端呈卵圆形（图3-6、图3-7）。
[CM（24]雌虫（n=5）：体长6.96～7.92 mm（7.68 mm），最大体宽294.8～345.3 μm（328.2 μm）。尾部直，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图3-8、图3-9）。阴门距肛门64.2～87.1 μm（76.4 μm），肛门距尾端86.3～98.2 μm（92.5 μm）。
3 结论与讨论
首次采用扫描电镜对冠环属3种线虫的体表结构进行了详细的观察和描述，结果发现3种线虫外部形态特征具有明显的差异：（1）冠状冠环线虫的外叶冠由22个小叶组成，小叶长18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部宽3.4～4.6 μm（4.1 μm）；大唇片冠环线虫外叶冠小叶为19个，小叶长 26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部宽4.2～5.3 μm（4.7 μm）；小唇片冠环线虫为18个小叶，小叶长11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部宽2.4～4.3 μm（3.5 μm）。外叶冠形态特征的差异是鉴定圆线虫种类的重要依据之一，外叶冠的形状和数量在光镜下有时难以辨别，但在扫描电镜下可以观察得十分清楚。在以往的报道中，只是对外叶冠小叶的数量进行了描述[8-10]，而本研究提供了更多、更具体的形态特征。（2）冠狀冠环线虫的4个亚中乳突起自口领基部，向口领顶部延伸呈隆起状；大唇片冠环线虫口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个大的唇形结构；小唇片冠环线虫口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个小的唇形结构。从观察结果来看，冠环属3种线虫亚中乳突基部的形态特征明显不同。大唇片冠环线虫和小唇片冠环线虫的头部特征比较相似，只是大唇片冠环线虫的口领基部形成4个特别显著的唇形隆起，而小唇片冠环线虫形成的唇形隆起小而低，与光镜下的观察结果[8-10]一致。（3）冠状冠环线虫雄虫生殖锥背唇上有1对卵圆形结构的附属物，中部相融合，上面分布着许多刚毛状突起；大唇片冠环线虫生殖锥背唇上约有10个大小不等的圆锥形附属物；小唇片冠环线虫生殖锥上有1个两端呈卵圆的月牙形附属物。生殖锥一般包埋在雄虫交合伞下面，不易被观察，而在扫描电镜下，生殖锥的立体感较强，结构非常清晰。本结果与Lichtenfels等的描述[9]稍有不同。在Lichtenfels等的报道中，大唇片冠环线虫生殖锥上有2对圆锥形突起，而小唇片冠环线虫生殖锥上有1对梨形附属物，中部相融合。笔者认为产生这些差异的原因可能有2个：一是由于地理分布不同造成的种内变异；二是由于在光镜下生殖锥附属物形态结构不容易分辨，使得研究者的描述和看法不同。（4）冠状冠环线虫雌虫尾部直，尾长174.2～194.1 μm（183.5 μm）；大唇片冠环线虫尾部粗壮，稍弯向背侧，尾长131.7～162.5 μm（143.9 μm）；小唇片冠环线虫尾部直，尾长86.3～98.2 μm（92.5 μm）。3种线虫雌虫尾部形态与以往的报道[8-10]基本一致。本研究结果进一步证明，通过扫描电镜能够清晰、准确地观察到线虫的体表结构特征，可以为线虫的分类鉴定提供更多、更详细的形态鉴别依据。
参考文献：
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[8]張路平，孔繁瑶. 马属动物的寄生线虫[M]. 北京：中国农业出版社，2002：53-62.[HJ1.8mm]
[9]Lichtenfels J R，Kharchenko V A，Dvojnos G M. Illustrated identification keys to strongylid parasites（Strongylidae：Nematoda）of horses，zebras and asses（Equidae）[J]. Veterinary Parasitology，2008，156（1/2）：4-161.
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[12]史梅青，张 莉，张路平. 山西和陕西两省鸟类寄生异刺属线虫的研究（线虫纲：异刺科）[J]. 四川动物，2010，29（4）：527-535.
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[14]卜艳珍，王小攀，赵鹏飞，等. 盅口属三种线虫扫描电镜的比较研究（杆形目，圆线科）[J]. 动物分类学报，2013，38（1）：27-32.
[15]Lichtenfels J R，Kharchenko V A，Krecek R C，et al. An annotated checklist by genus and species of 93 species level names for 51 recognized species of small strongyles（Nematoda：Strongyloidea：Cyathostominea）of horses，asses and zebras of the world[J]. Veterinary Parasitology，1998，79（1）：65-79.
关键词：冠状冠环线虫；大唇片冠环线虫；小唇片冠环线虫；体表结构；扫描电镜
中图分类号：Q959.17；S432.4 5 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0214-04
冠环属（Coronocyclus）线虫隶属于圆线目（Strongylida）圆线科（Strongylidae）盅口亚科（Cyathostominae），是马属动物肠道内感染率较高的寄生圆线虫，往往造成宿主消瘦、贫血甚至死亡[1-5]。1986年，德国学者Hartwich对盅口族（Cyathostominea）线虫进行了分类修订，根据角质支环与口囊壁前端完全分开这一特征建立了一个新属——冠环属（Coronocyclus），并将盅口属（Cyathostomum）的4个种移入该属，即冠状冠环线虫（C. coronatus）、大唇片冠环线虫（C. labiatus）、小唇片冠环线虫（C. labratus）和箭状冠环线虫（C. sagittatus）[6]。随后，Dvojnos等又发现了一个新种，命名为尤氏冠环线虫（C. ulambajari）[7]。近几年来，笔者对河南省驴肠道寄生线虫的感染情况进行了调查，仅采集到冠状冠环线虫、大唇片冠环线虫和小唇片冠環线虫3种冠环线虫。尽管国内外学者在光镜下已经对这3种线虫作了详细的描述[8-10]，但是尚未见扫描电镜的相关报道。由于扫描电镜技术可以更直观、更清晰地观察到线虫的体表结构特征，因此被广泛应用于线虫的分类鉴定[11-14]。本研究首次应用扫描电镜技术对冠环属3种线虫的体表特征进行观察和比较，不仅可以为线虫的分类鉴定提供更多、更具体的形态学依据，同时还可以为马属动物线虫病的诊断和防治提供参考依据。
1 材料与方法
采自河南省驴肠道内的线虫标本经过处理后，固定保存于70%乙醇中。固定标本先用乳酸苯酚溶液（2份甘油、1份苯酚饱和溶液、1份乳酸、1份水）透明，然后在光学显微镜下进行形态学初步鉴定，种类鉴定主要采用张路平等提出的分类系统标准[8-9，15]。标本保存于河南师范大学生命科学学院。
挑选冠环属3种线虫雌雄虫体各5头，用于扫描电镜观察。先用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH值 7.2）充分漂洗干净，再用2.5%戊二醛固定3 h，经磷酸缓冲液漂洗后，放入1%锇酸固定1.5 h，再经磷酸缓冲液漂洗，各级乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，喷金镀膜后，在S-570扫描电镜下观察和拍照（工作电压15 kV）。
2 结果与分析
2.1 冠状冠环线虫
口领显著，头部顶面观呈圆形。4个亚中乳突起自口领基部向顶部延伸呈隆起状，到达口领顶部后，突出口领之上呈子弹形（图1-1、图1-2、图1-3），乳突长9.7～11.8 μm（10.9 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图1-4）。口孔较大，近似圆形，直径为39.4～41.3 μm（40.2 μm）。口孔周围环绕着1圈外叶冠，由22个小叶组成，小叶长18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部宽3.4～4.6 μm（4.1 μm），小叶末端钝圆，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领表面（图1-2、图1-3）。
雄虫（n=5）：体长7.45～8.51 mm（7.92 mm），最大体宽341.3～392.5 μm（370.2 μm）。尾部具有发达的交合伞，由1个较长的背叶和2个卵圆形的侧叶组成，背叶和侧叶分界明显（图1-5、图1-6）。生殖锥短，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上有1对卵圆形结构的附属物，中部相融合，上面分布着许多刚毛状突起（图1-7）。
雌虫（n=5）：体长8.90～10.09 mm（10.01 mm），最大体宽372.4～453.2 μm（411.7 μm）。尾部直，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图1-8、图1-9）。阴门距肛门110.2～120.4 μm（116.3 μm），肛门距尾端174.2～194.1 μm（183.5 μm）。
2.2 大唇片冠环线虫
口领显著， 头部顶面观呈圆形。口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个大的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突，亚中乳突的大部分与唇片结合在一起，只有顶部游离在唇片的外面（图2-1、图2-2、图2-3），乳突长6.1～7.2 μm（6.8 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图2-3）。口孔较大，近似圆形，直径41.5～46.8 μm（44.3 μm）。口孔周围环绕着1外叶冠，由19个小叶组成，小叶长26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部宽4.2～5.3 μm（4.7 μm），小叶末端钝圆，向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领的表面（图2-3、图2-4）。 雄虫（n=5）：体长7.65～8.19 mm（7.94 mm），最大体宽312.6～428.3 μm（364.7 μm）。尾部具有发达的交合伞，背叶较宽阔，稍长于侧叶，背叶和侧叶分界不明显（图2-5、图2-6）。生殖锥短，卵圆形，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上分布着约10个大小不等的圆锥形附属物（图2-7）。
雌虫（n=5）：体长9.76～11.23 mm（10.54 mm），最大体宽413.6～542.3 μm（486.7 μm）。尾部粗壮，稍弯向背侧，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图2-8、图2-9）。阴门距肛门105.3～116.4 μm（112.1 μm），肛门距尾端131.7～162.5 μm（143.9 μm）。
2.3 小唇片冠环线虫
口领显著，头部顶面观呈圆形。口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个小的唇形结构，每个唇片的基部中央伸出1个亚中乳突，亚中乳突仅基部与唇片结合在一起，其他大部分游离在唇片的外面（图3-1、图3-2、图3-3），乳突长5.9～6.8 μm（6.3 μm）。口领顶端两侧各有1个头感器，头感器小，稍微隆起，中间有一裂缝（图3-2）。口孔稍小，近似圆形，直径为32.6～35.5 μm（34.7 μm）。口孔周围环绕着1圈外叶冠，由18个小叶组成，小叶长11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部宽2.4～4.3 μm（3.5 μm），小叶末端钝圆，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外叶冠的起始部位低于口领表面（图3-1、图3-2）。
雄虫（n=5）：体长5.67～6.78 mm（6.54 mm），最大体宽238.4～297.1 μm（254.8 μm）。尾部具有发达的交合伞，由1个稍长的背叶和2个卵圆形的侧叶组成，背叶和侧叶分界明显（图3-4、图3-5）。生殖锥短小，由腹唇和背唇组成，两唇之间的横裂即为泄殖孔。背唇上有1个月牙状的附属物，两端呈卵圆形（图3-6、图3-7）。
[CM（24]雌虫（n=5）：体长6.96～7.92 mm（7.68 mm），最大体宽294.8～345.3 μm（328.2 μm）。尾部直，尾尖呈指形。阴门卵圆形，靠近肛门。肛门横裂，呈月牙形（图3-8、图3-9）。阴门距肛门64.2～87.1 μm（76.4 μm），肛门距尾端86.3～98.2 μm（92.5 μm）。
3 结论与讨论
首次采用扫描电镜对冠环属3种线虫的体表结构进行了详细的观察和描述，结果发现3种线虫外部形态特征具有明显的差异：（1）冠状冠环线虫的外叶冠由22个小叶组成，小叶长18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部宽3.4～4.6 μm（4.1 μm）；大唇片冠环线虫外叶冠小叶为19个，小叶长 26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部宽4.2～5.3 μm（4.7 μm）；小唇片冠环线虫为18个小叶，小叶长11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部宽2.4～4.3 μm（3.5 μm）。外叶冠形态特征的差异是鉴定圆线虫种类的重要依据之一，外叶冠的形状和数量在光镜下有时难以辨别，但在扫描电镜下可以观察得十分清楚。在以往的报道中，只是对外叶冠小叶的数量进行了描述[8-10]，而本研究提供了更多、更具体的形态特征。（2）冠狀冠环线虫的4个亚中乳突起自口领基部，向口领顶部延伸呈隆起状；大唇片冠环线虫口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个大的唇形结构；小唇片冠环线虫口领内上缘在背腹面和侧面向内延伸形成4个小的唇形结构。从观察结果来看，冠环属3种线虫亚中乳突基部的形态特征明显不同。大唇片冠环线虫和小唇片冠环线虫的头部特征比较相似，只是大唇片冠环线虫的口领基部形成4个特别显著的唇形隆起，而小唇片冠环线虫形成的唇形隆起小而低，与光镜下的观察结果[8-10]一致。（3）冠状冠环线虫雄虫生殖锥背唇上有1对卵圆形结构的附属物，中部相融合，上面分布着许多刚毛状突起；大唇片冠环线虫生殖锥背唇上约有10个大小不等的圆锥形附属物；小唇片冠环线虫生殖锥上有1个两端呈卵圆的月牙形附属物。生殖锥一般包埋在雄虫交合伞下面，不易被观察，而在扫描电镜下，生殖锥的立体感较强，结构非常清晰。本结果与Lichtenfels等的描述[9]稍有不同。在Lichtenfels等的报道中，大唇片冠环线虫生殖锥上有2对圆锥形突起，而小唇片冠环线虫生殖锥上有1对梨形附属物，中部相融合。笔者认为产生这些差异的原因可能有2个：一是由于地理分布不同造成的种内变异；二是由于在光镜下生殖锥附属物形态结构不容易分辨，使得研究者的描述和看法不同。（4）冠状冠环线虫雌虫尾部直，尾长174.2～194.1 μm（183.5 μm）；大唇片冠环线虫尾部粗壮，稍弯向背侧，尾长131.7～162.5 μm（143.9 μm）；小唇片冠环线虫尾部直，尾长86.3～98.2 μm（92.5 μm）。3种线虫雌虫尾部形态与以往的报道[8-10]基本一致。本研究结果进一步证明，通过扫描电镜能够清晰、准确地观察到线虫的体表结构特征，可以为线虫的分类鉴定提供更多、更详细的形态鉴别依据。
参考文献：
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