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摘要
[目的]筛选出对酿酒酵母重组菌转化产生γ氨基丁酸（GABA）具有影响的主要因素。[方法]利用PlackettBurman试验设计对谷氨酸脱羧酶基因（GAD 1）高效表达重组菌Saccharomyces cerevisiae DL28转化产GABA的主要影响因子，如菌体浓度、底物浓度、转化温度、转速、转化时间及起始pH等进行研究，筛选出主要影响因素。[结果]试验表明，菌体浓度（P=0.012 3）、转化时间（P=0.047 5）及起始pH（P=0.001 9）对转化产生GABA具有显著影响。[结论]研究可为进一步优化菌株DL28产GABA转化条件提供理论依据与实践基础。
关键词酿酒酵母；γ氨基丁酸；发酵条件；影响因素；筛选
中图分类号S509.9文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）23-258-03
Abstract [Objective] To screen out main factors affecting transformation of the γ aminobutyric acid from Saccharomyces cerevisiae DL28. [Method]The PlackettBurnam design was applied to screen out the key factors from the following components， namely， cell concentration， substrate concentration， transition temperature， rotary speed， transformation time and initial pH， which would affect the γaminobutyric acid production of the recombinant strain Saccharomyces cerevisiae DL28 with high expressive glutamic acid decarboxylase genes. [Result] It was found that cell concentration（P=0.012 3）， transformation time （P=0.047 5） and initial pH （P=0.001 9） were the significant factors for the GABA production of Saccharomyces cerevisiae DL28. [Conclusion] This provides a theoretical foundation and practical basis for the further optimization of conversion conditions producing GABA of strain DL28.
Key wordsSaccharomyces cerevisiae； γAmino butyric acid （GABA）；Fermentation conditions；Influence factors；Screening
γ氨基丁酸（γaminobutyric acid）简称GABA，是谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）生物催化L谷氨酸或钠盐α羧基脱羧反应而产生的非蛋白质组成的天然氨基酸[1-2]，为哺乳动物中枢神经系统的一种主要的抑制性神经递质[3]，广泛存在于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中[4]，具有许多重要的生理功能，如降血压[5]、镇痛[6]、治疗哮喘[7]等。近年来，GABA相关功能性食品的开发引人关注，其中植物富集法（米胚、米糠、绿茶等）和微生物发酵法（乳酸菌、酵母）制得的富含GABA食品都获得了良好的社会价值和经济效益。因此，GABA作为一种功能性因子越来越广泛地用于食品、医药及化工等行业[8-11]。
酵母菌是单细胞真核生物，在我国已有2 000多年的使用历史，如在酿酒业上的应用，也是我国重要的微生物资源[12-13]。据研究报道，已筛选出发酵产生较高GABA产量的酵母菌株，如Candida parapsilosis GPT511为1.76 g/L[14]、产GABA酵母菌株的GABA产量达1.69 g/L[15]、Saccharomyces uvarum 4#为3.653 g/L[16]等。
PlackettBurman试验设计是一种经济而有效的二水平试验设计方法，试验组合数量较少也满足试验要求，且因子的交互作用仅部分的与主因子发生混淆[17]，应用于生物工艺优化研究中的报道很多，如粪肠球菌HX36产γ氨基丁酸发酵条件的优化[11]、嗜酸乳杆菌NX26产细菌素的发酵条件优化[18]等。笔者通过PlackettBurman设计对酿酒酵母重组菌转化产生GABA具有影响的内在因素和外在因素进行研究，筛选出主要影响因素，为其发酵条件的优化提供试验数据具有重要实际意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株。S.cerevisiae DL28是中国科学院微生物研究所工业微生物与生物技术研究室将产GABA的S.cerevisiae 28[19]通过聚合酶链反应和核酸体外扩增技术改良的谷氨酸脱羧酶基因（GAD 1）高效表达的重组菌株。
1.1.2主要培养基及试剂。
YEPD液体培养基根据文献[20-21]介绍的方法配制；GABA标样，Sigma公司；L谷氨酸，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂及药品均为分析纯。 1.1.3主要设备。Eppendorf高速冷冻离心机，5415R型和5804R型；分光光度计，SHIMADZU UV2450型。
1.2试验方法
1.2.1菌株DL28的培养及菌悬液的制备。
将S.cerevisiae DL28菌株接种于5 ml YEPD液体培养基中，置29 ℃、摇床培养12～24 h。传代培养2次后接种于YEPD液体培养基中，置29 ℃、摇床培养12 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃掉上清液，加入与培养液等量的灭菌生理盐水（约5 ml），振荡混匀，再次离心，同法洗涤2次。然后，弃掉上清液的菌体加入4.5 ml灭菌生理盐水，振荡混匀，即成为供试菌液。
1.2.2标准曲线的建立。采用Berthelot法[21-22]建立GABA标准曲线，即取30 mmol/ml标准GABA溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 ml，依次加30 mmol/ml LGlu溶液0.35、0.30、0.20、0.10、0 ml，混合，加入0.2 ml碳酸钠溶液（1.0 mol/L）混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液（0.2 mol/L），混匀，加入1.0 ml 6.0%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在波长640 nm下测定其吸光值，以LGlu溶液做空白对照。
以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.3转化液中GABA含量的测定[22-23]。转化液中GABA含量的测定方法同上。将转化液0.5 ml与0.2 ml碳酸钠溶液混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液，混匀，加入1.0 ml 6%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在640 nm下测定其吸光值。
1.2.4GABA转化条件关键影响因子的筛选——PlackettBurman设计。
通过Berthelot法以菌体浓度、底物浓度及起始pH等6个因素作为研究对象，从中筛选对菌株DL28转化产生GABA有显著影响的因子。选取的6个因素及其代码、编码水平见表1，其响应值为每组转化液中GABA含量（mmol/L）。利用JMP软件进行试验设计、数据分析及模型的建立。该试验采用二水平PlackettBurman设计，试验设计见表1。
2结果与分析
2.1GABA标准曲线的建立
通过Berthelot比色法，以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值（A640）为纵坐标绘制标准曲线，GABA的标准曲线见图1。
经数据分析得知，GABA的标准曲线回归方程式为Y=0.014 4X+0.412 1，相关系数R2=0.999。因此，待测转化液中GABA浓度在4.0～30.0 mmol/L的范围内与吸光值的相关性很好。
2.2转化液中GABA含量的测定
PB试验结果及其响应值见表2，各因素方差分析见表3。采用JMP软件对表3中的Y值（GABA含量）进行方差分析，该数据具有统计学意义（P<0.000 1）。通过逐步回归分析，得到转化液GABA含量为响应值的最优多元线性回归方程（α=0.05）：
=13.046 25+3.173 75×（x1-2）+ 2.068 75×（x5-36）/12+5.311 25×（x6-4.5）/0.5
式中，为GABA含量预测值；由自变量编码方程可知，x1 =（菌体浓度-2）/1，x5=（转化时间-36）/12，x6 =（起始pH-4.5）/0.5。
方差分析表明，所得最优多元线性回归方程达到极显著（P<0.000 1），而且各因子系数均有意义（P<0.05）。该回归模型在被研究的整个回归区域拟合的很好。决定系数R2=0.952 076和R2Adj=0.916 133，Y值（GABA含量）表明95.2%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。由偏回归系数及显著性检验得到影响菌株DL28转化GABA主要影响因子为：菌体浓度（P=0.012 3）、转化时间（P=0.047 5）和起始pH（P=0.001 9）。
S.cerevisiae DL28转化产生GABA的含量受内条件（如菌体浓度、底物浓度等）和外条件（如转化温度、转化时间等）的制约。因此，为提高该菌株通过转化产生GABA的含量，首先从众多的相关影响因素中筛选出主要影响因子，并了解转化因素之间的相互作用是至关重要的。由显著因素的偏回归系数和重要影响因子动态预测图（图2）可知，在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势。
谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，是生物体催化L谷氨酸或钠盐脱羧反应生成非蛋白质组成的天然氨基酸GABA的唯一酶[24-25]。因此，GAD的含量和活性对GABA产量的影响最重要，该研究中菌体浓度、转化时间及起始pH对菌株DL28转化产GABA的产量具有显著影响也说明了这一点，如菌体浓度对应GAD的含量，而转化时间和起始pH是对应GAD活性。据研究报道，Candida parapsilosis GPT511合成γ氨基丁酸的最佳pH为6.5和37 ℃发酵时间为48 h[26]；酵母菌突变菌株的最佳接种量为4%、起始pH为5.5及37 ℃培养时间为4 d[27]；L.plantarum LpL328的固定化细胞在菌体浓度为6%、pH为4.7及37 ℃培养20 h时GABA最高催化产量为0.96 g/L[28]；Lactococcus lactis 1.009的细胞在菌体浓度为10 g/L、pH 4.7的醋酸缓冲液及50 ℃下反应60 h时GABA的积累量可达19.1 g/L，转化率为99.9%[29]等。增加菌体浓度和延长转化时间对GABA产量具有促进作用，但乳酸菌的GAD的最适起始pH相对低于酵母菌，原因由菌株特性所致。 用上述方程对转化液GABA含量最大预期值及合意性（图2）进行分析，可知欲得到较高的含GABA的转化液，需提高菌体浓度和起始pH，并延长转化时间。
3结论
利用PB试验设计对S.cerevisiae DL28转化产GABA的菌体浓度、底物浓度、转化温度等6个相关因素进行主要影响因子的筛选，发现在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随着菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势，其他相关因素没有显著效应。通过动态预期图直观地了解到各因素的效应趋势及大致水平范围，为进一步优化酵母菌转化产GABA的工艺参数提供了重要的理论依据与实践基础。
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[目的]筛选出对酿酒酵母重组菌转化产生γ氨基丁酸（GABA）具有影响的主要因素。[方法]利用PlackettBurman试验设计对谷氨酸脱羧酶基因（GAD 1）高效表达重组菌Saccharomyces cerevisiae DL28转化产GABA的主要影响因子，如菌体浓度、底物浓度、转化温度、转速、转化时间及起始pH等进行研究，筛选出主要影响因素。[结果]试验表明，菌体浓度（P=0.012 3）、转化时间（P=0.047 5）及起始pH（P=0.001 9）对转化产生GABA具有显著影响。[结论]研究可为进一步优化菌株DL28产GABA转化条件提供理论依据与实践基础。
关键词酿酒酵母；γ氨基丁酸；发酵条件；影响因素；筛选
中图分类号S509.9文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）23-258-03
Abstract [Objective] To screen out main factors affecting transformation of the γ aminobutyric acid from Saccharomyces cerevisiae DL28. [Method]The PlackettBurnam design was applied to screen out the key factors from the following components， namely， cell concentration， substrate concentration， transition temperature， rotary speed， transformation time and initial pH， which would affect the γaminobutyric acid production of the recombinant strain Saccharomyces cerevisiae DL28 with high expressive glutamic acid decarboxylase genes. [Result] It was found that cell concentration（P=0.012 3）， transformation time （P=0.047 5） and initial pH （P=0.001 9） were the significant factors for the GABA production of Saccharomyces cerevisiae DL28. [Conclusion] This provides a theoretical foundation and practical basis for the further optimization of conversion conditions producing GABA of strain DL28.
Key wordsSaccharomyces cerevisiae； γAmino butyric acid （GABA）；Fermentation conditions；Influence factors；Screening
γ氨基丁酸（γaminobutyric acid）简称GABA，是谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）生物催化L谷氨酸或钠盐α羧基脱羧反应而产生的非蛋白质组成的天然氨基酸[1-2]，为哺乳动物中枢神经系统的一种主要的抑制性神经递质[3]，广泛存在于从单细胞生物到哺乳动物的各种有机体活细胞中[4]，具有许多重要的生理功能，如降血压[5]、镇痛[6]、治疗哮喘[7]等。近年来，GABA相关功能性食品的开发引人关注，其中植物富集法（米胚、米糠、绿茶等）和微生物发酵法（乳酸菌、酵母）制得的富含GABA食品都获得了良好的社会价值和经济效益。因此，GABA作为一种功能性因子越来越广泛地用于食品、医药及化工等行业[8-11]。
酵母菌是单细胞真核生物，在我国已有2 000多年的使用历史，如在酿酒业上的应用，也是我国重要的微生物资源[12-13]。据研究报道，已筛选出发酵产生较高GABA产量的酵母菌株，如Candida parapsilosis GPT511为1.76 g/L[14]、产GABA酵母菌株的GABA产量达1.69 g/L[15]、Saccharomyces uvarum 4#为3.653 g/L[16]等。
PlackettBurman试验设计是一种经济而有效的二水平试验设计方法，试验组合数量较少也满足试验要求，且因子的交互作用仅部分的与主因子发生混淆[17]，应用于生物工艺优化研究中的报道很多，如粪肠球菌HX36产γ氨基丁酸发酵条件的优化[11]、嗜酸乳杆菌NX26产细菌素的发酵条件优化[18]等。笔者通过PlackettBurman设计对酿酒酵母重组菌转化产生GABA具有影响的内在因素和外在因素进行研究，筛选出主要影响因素，为其发酵条件的优化提供试验数据具有重要实际意义。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株。S.cerevisiae DL28是中国科学院微生物研究所工业微生物与生物技术研究室将产GABA的S.cerevisiae 28[19]通过聚合酶链反应和核酸体外扩增技术改良的谷氨酸脱羧酶基因（GAD 1）高效表达的重组菌株。
1.1.2主要培养基及试剂。
YEPD液体培养基根据文献[20-21]介绍的方法配制；GABA标样，Sigma公司；L谷氨酸，国药集团化学试剂有限公司；其他试剂及药品均为分析纯。 1.1.3主要设备。Eppendorf高速冷冻离心机，5415R型和5804R型；分光光度计，SHIMADZU UV2450型。
1.2试验方法
1.2.1菌株DL28的培养及菌悬液的制备。
将S.cerevisiae DL28菌株接种于5 ml YEPD液体培养基中，置29 ℃、摇床培养12～24 h。传代培养2次后接种于YEPD液体培养基中，置29 ℃、摇床培养12 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃掉上清液，加入与培养液等量的灭菌生理盐水（约5 ml），振荡混匀，再次离心，同法洗涤2次。然后，弃掉上清液的菌体加入4.5 ml灭菌生理盐水，振荡混匀，即成为供试菌液。
1.2.2标准曲线的建立。采用Berthelot法[21-22]建立GABA标准曲线，即取30 mmol/ml标准GABA溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 ml，依次加30 mmol/ml LGlu溶液0.35、0.30、0.20、0.10、0 ml，混合，加入0.2 ml碳酸钠溶液（1.0 mol/L）混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液（0.2 mol/L），混匀，加入1.0 ml 6.0%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在波长640 nm下测定其吸光值，以LGlu溶液做空白对照。
以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.2.3转化液中GABA含量的测定[22-23]。转化液中GABA含量的测定方法同上。将转化液0.5 ml与0.2 ml碳酸钠溶液混合，加入1.0 ml四硼酸钠缓冲液，混匀，加入1.0 ml 6%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸钠溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在640 nm下测定其吸光值。
1.2.4GABA转化条件关键影响因子的筛选——PlackettBurman设计。
通过Berthelot法以菌体浓度、底物浓度及起始pH等6个因素作为研究对象，从中筛选对菌株DL28转化产生GABA有显著影响的因子。选取的6个因素及其代码、编码水平见表1，其响应值为每组转化液中GABA含量（mmol/L）。利用JMP软件进行试验设计、数据分析及模型的建立。该试验采用二水平PlackettBurman设计，试验设计见表1。
2结果与分析
2.1GABA标准曲线的建立
通过Berthelot比色法，以GABA浓度为横坐标，波长640 nm处的吸光值（A640）为纵坐标绘制标准曲线，GABA的标准曲线见图1。
经数据分析得知，GABA的标准曲线回归方程式为Y=0.014 4X+0.412 1，相关系数R2=0.999。因此，待测转化液中GABA浓度在4.0～30.0 mmol/L的范围内与吸光值的相关性很好。
2.2转化液中GABA含量的测定
PB试验结果及其响应值见表2，各因素方差分析见表3。采用JMP软件对表3中的Y值（GABA含量）进行方差分析，该数据具有统计学意义（P<0.000 1）。通过逐步回归分析，得到转化液GABA含量为响应值的最优多元线性回归方程（α=0.05）：
=13.046 25+3.173 75×（x1-2）+ 2.068 75×（x5-36）/12+5.311 25×（x6-4.5）/0.5
式中，为GABA含量预测值；由自变量编码方程可知，x1 =（菌体浓度-2）/1，x5=（转化时间-36）/12，x6 =（起始pH-4.5）/0.5。
方差分析表明，所得最优多元线性回归方程达到极显著（P<0.000 1），而且各因子系数均有意义（P<0.05）。该回归模型在被研究的整个回归区域拟合的很好。决定系数R2=0.952 076和R2Adj=0.916 133，Y值（GABA含量）表明95.2%的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。由偏回归系数及显著性检验得到影响菌株DL28转化GABA主要影响因子为：菌体浓度（P=0.012 3）、转化时间（P=0.047 5）和起始pH（P=0.001 9）。
S.cerevisiae DL28转化产生GABA的含量受内条件（如菌体浓度、底物浓度等）和外条件（如转化温度、转化时间等）的制约。因此，为提高该菌株通过转化产生GABA的含量，首先从众多的相关影响因素中筛选出主要影响因子，并了解转化因素之间的相互作用是至关重要的。由显著因素的偏回归系数和重要影响因子动态预测图（图2）可知，在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势。
谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，是生物体催化L谷氨酸或钠盐脱羧反应生成非蛋白质组成的天然氨基酸GABA的唯一酶[24-25]。因此，GAD的含量和活性对GABA产量的影响最重要，该研究中菌体浓度、转化时间及起始pH对菌株DL28转化产GABA的产量具有显著影响也说明了这一点，如菌体浓度对应GAD的含量，而转化时间和起始pH是对应GAD活性。据研究报道，Candida parapsilosis GPT511合成γ氨基丁酸的最佳pH为6.5和37 ℃发酵时间为48 h[26]；酵母菌突变菌株的最佳接种量为4%、起始pH为5.5及37 ℃培养时间为4 d[27]；L.plantarum LpL328的固定化细胞在菌体浓度为6%、pH为4.7及37 ℃培养20 h时GABA最高催化产量为0.96 g/L[28]；Lactococcus lactis 1.009的细胞在菌体浓度为10 g/L、pH 4.7的醋酸缓冲液及50 ℃下反应60 h时GABA的积累量可达19.1 g/L，转化率为99.9%[29]等。增加菌体浓度和延长转化时间对GABA产量具有促进作用，但乳酸菌的GAD的最适起始pH相对低于酵母菌，原因由菌株特性所致。 用上述方程对转化液GABA含量最大预期值及合意性（图2）进行分析，可知欲得到较高的含GABA的转化液，需提高菌体浓度和起始pH，并延长转化时间。
3结论
利用PB试验设计对S.cerevisiae DL28转化产GABA的菌体浓度、底物浓度、转化温度等6个相关因素进行主要影响因子的筛选，发现在各项影响因素的2个水平范围内，菌体浓度、转化时间和起始pH均对菌株DL28转化GABA为正效应，即随着菌体浓度的增加、起始pH的提高及转化时间的延长，GABA含量呈增加趋势，其他相关因素没有显著效应。通过动态预期图直观地了解到各因素的效应趋势及大致水平范围，为进一步优化酵母菌转化产GABA的工艺参数提供了重要的理论依据与实践基础。
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