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摘 要：采用碳化二亚胺法将三聚氰胺偶联到牛血清白蛋白上合成免疫原三聚氰胺-牛血清白蛋白。合成的抗原进行紫外扫描鉴定，利用辣根过氧化物酶合成HRP-MEL-BSA酶标抗原，利用固相抗体酶标抗原来进行效价的测定，检测抗原的合成。
关键词：三聚氰胺；人工抗原；ELISA
中图分类号 S13 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）10-19-03
三聚氰胺（Melamine），IUPAC命名为“1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基”，化学式为C3H6N6[1]。18世纪以来，三聚氰胺已经被作为一种重要的工业原材料在使用，因其含氮量高被作为庄稼的肥料[2]，被作为耐火材料添加到油漆、塑料盒纸张、建筑中[3，4]。从其化学式看出15个原子中，含有6个氮原子，氮含量达66.67%左右[5]，常被作为伪劣的高蛋白掺杂在牛奶、食品、饲料中[6，7]，造成蛋白质含量虚高的假象[8]。本实验主要合成具有活性的三聚氰胺人工抗原，用竞争结合实验验证了三聚氰胺人工抗原合成成功，旨在为制备三聚氰胺抗体和三聚氰胺ELISA试剂盒奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 三聚氰胺，纯度99.5%，购于天津光复精细化工研究所；牛血清白蛋白，购买于厦门市科展；三聚氰胺抗体，本实验室之前已合成。
1.1.2 实验仪器 KHB ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司制造；离心机，法国thermo tlectron industries sas 制造；KQ-500DE数控超声波，舒美昆山市超声仪器有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计。
1.2 三聚氰胺人工抗原的合成 参照董国伟等的文献[9]准确称取10mg（0.07mmol）三聚氰胺（MEL）、150mg（0.002mmol）牛血清白蛋白（BSA）、50mg的EDC，分别溶于1mL丙三醇、3mL和3mL PBS中，漩涡混匀。4℃冰浴下避光搅拌反应4h，再向混合溶液中滴加剩下的1mL EDC溶液，继续冰浴下反应24h，以4 000r/min离心3min取上清液装入透析袋，于0.01mol/L、pH7.4的PBS中4℃定时透析3d，留部分进行鉴定，试管分装并进行冷冻真空干燥，合成物于-20℃条件下冷冻保存。
1.3 人工抗原结构鉴定 在本实验紫外测试OD值的范围内，确定3种物质浓度的条件下，三聚氰胺和牛血清白蛋白均有各自不同的紫外特征吸收峰。根据比尔定律可知，物质对光的吸收即OD值与该物质的浓度有一定的比例关系可推算出偶联比计算公式如下[10]：
偶联比=[（OD偶-OD载）×ρ半抗原×M载OD半抗原×M半抗原×ρ载×ρ偶] （1）
1.4 酶标抗原的合成
1.4.1 过碘酸钠法合成三聚氰胺酶标抗原 将10mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于2mL超纯水，滴加0.4mL新配的0.1mol/L NaIO4，漩涡混匀。滴加0.4mL新配的0.2mol/L乙二醇，漩涡混匀。用0.001mol/L、pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析9h，恢复室温混匀，将活化的HRP溶液逐滴加到用2mL CBS包被液溶解的冷冻干燥的5mg MEL-BSA溶液中。室温避光磁力搅拌30min，用2mol/L NaOH调pH值到 9.5，避光搅拌1h。加入0.2mL用超纯水新配的4mg/mL NaBH4，4℃反应2h。用PBS充分透析，于-20℃下分装进行保存[11]。
1.4.2 戊二醛交联法 将10mg HRP溶于0.2mL含1.25%戊二醛的pH6.8、0.1mol/L PBS中，放置室温18h，充分透析，记录时间，以除去多余的戊二醛。加生理盐水至1mL然后加5mg纯化的抗原及其0.1mL、pH9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，混合于4℃冰箱放置24h，加入0.1mL、0.2mol/L赖氨酸溶液，室温放置2h。用PBS充分透析，离心除沉淀，上清即为酶结合物。
1.5 紫外鉴定 将MEL-BSA-HRP、HRP、MEL-BSA均用PBS配成0.5mg/mL的溶液，用PBS调零，在200～500nm波长范围内进行扫描吸收曲线并且加以比较。
1.6 直接竞争ELISA法鉴定人工抗原及酶标抗原合成 第一步包被抗体： 用0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲溶液（简称CBS）稀释抗体稀释成不同浓度，用移液枪滴加酶标板上，37℃包被2h。第二步封闭：取出将包被好的酶标板，待其恢复至室温后，用洗涤缓冲液洗涤。加1%BSA-PBS 300μL/每孔封闭，置于37℃水浴恒温箱中温育30min，也可以室温避光封闭1h，必须严格控制封闭时间。第三步酶标抗原： 将封闭好的酶标板取出，待其恢复至室温后，甩去包被液，用洗涤缓冲溶液洗涤后，依次加入用PBS稀释的酶标抗原（从100倍起，对倍稀释）100μL/孔，每个浓度重复3孔，以PBST为空白对照，置于37℃水浴恒温箱中温育1h。第四步加底物： 将加入酶标抗体的酶标板取出，待其恢复至室温，用洗涤缓冲溶液洗涤后，加TMB液100μL/孔，置于37℃恒温箱中15min。现象由无色变为蓝色。第五步终止反应： 取出酶标板，直接加入2mol/L硫酸50μL/孔，反应液从黄色变成棕色。
测定：用酶标仪测定终止反应后的酶标板的OD450值。以OD450值接近1.0时的酶标抗体稀释后的浓度为其效价，并根据其效价。
2 结果与分析
2.1 人工抗原合成紫外扫描结果 从图1中可以看出三聚氰胺的特征峰在219nm附近，牛血清白蛋白在228nm和278nm附近均有吸收峰，人工抗原MEL-BSA在225nm和266nm附近均有吸收峰。MEL-BSA保留了牛血清白蛋白在228处最大吸收峰并且发生了偏移。偶联物MEL-BSA在266nm附近有吸收峰与龚云飞等[12]写的三聚氰胺人工抗原及多克隆抗体的制备报道的一致。 2.2 人工抗原偶联比 本实验制备的三聚氰胺人工免疫原，在波长位241nm处，半抗原、载体蛋白、偶联物均有较强的紫外吸收，根据公式（1）可计算得出半抗原与载体蛋白偶联比为29.35：1，偶联比较高。
2.3 酶标抗原合成紫外扫描结果 由图2可知，反应产物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的叠加，说明反应产物是MEL-BSA和HRP的结合物，表明偶联成功，酶标抗原合成成功。
由图3可知，反应产物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的叠加，说明反应产物是MEL-BSA和HRP的结合物，表明偶联成功，酶标抗原合成成功。
由图2和图3比较可以看出，戊二醛交联法吸收峰的叠加主要在200～300nm区间，而辣根过氧化物的吸收峰在350～450的区间范围内，而戊二醛交联法的吸收峰明显高于HRP可能是造成了HRP之间的交联。所以采用改良的过碘酸钠法来酶标抗原效果比戊二醛法交联法好。
2.4 固相抗原-酶标抗体棋盘滴定法数据 由表1可以看出抗原的浓度为1：3 200，抗体的浓度为1：8 000时，酶标仪的数据为1.028，此位置抗原和抗体消耗的量均少，效果又好，表明三聚氰胺人工抗原合成成功。
3 讨论
本实验通过紫外鉴定和三聚氰胺抗原抗体的竞争结合实验来直接证明三聚氰胺人工抗原是否合成，能够在短时间内进行验证，由于抗体合成时间较长（1～2月），利用本实验室之前合成好的三聚氰胺抗体进行验证，三聚氰胺半抗原的偶联比为29.35：1，说明三聚氰胺结合在牛血清白蛋白上的数量大，所携带的抗原决定簇多，容易刺激机体产生特异性抗体。接下来可进行三聚氰胺抗体的合成，并为三聚氰胺ELISA试剂盒的研制提供了基础。
参考文献
[1]李项华.问题奶粉罪魁祸首——三聚氰胺[J].中国计量，2008，10（2）42-43.
[2]R.D. Hauck，H.F. Stephenson. Fertilizer Nitrogen Sources 12，1964：147.
[3]Ashford’s Dictionary of Industrial Chemicals[M].3rd edn. ISBN： 978-0-9522674-3-0，2011：5 713.
[4]Bizzari S，Yokose K.Melamine. In： Chemical economics handbook[M].Menlo Park，CA，SRI Consulting，Inc， 2008.
[5]王永占，赵艳平，刘天阳.第三代气相萃冷三聚氰胺生产工艺[J].石油和化工节能，2011，3（4）15-18.
[6]Wang JB，Ndong M，Kai H，Matsuno K，Kayama F.Placental transfer of melamine and its effects on rat dams andfetuses[J].Food Chem Toxicol，2010，48：1791.
[7]Squadrone S，Ferro GL，Marchis D，Mauro C，Palmegiano P，AmatoG，Poma Genin E，Abete MC. Determination of melamine infeed： Validation of a gas chromatography–mass spectrometry method according to 2004/882/CE regulation[J].Food Control，2010，21：714.
[8]薛树科，宋金凤，时丽艳，等.乳制品中三聚氰胺检测研究进展[J].河北化工，2010，33（9）：21-23.
[9]董国伟，王末，刘贤进，等.兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备[J].华中农业大学学报，2001，20（4）：340-343.
[10]李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002.
[11]张道宏，石德时，毕丁仁.氯霉素检测试剂盒的初步评价及鉴定[D].武汉：华中农业大学，2007.
[12]王旻子，应永飞，龚云飞，等.三聚氰胺人工抗原的合成与鉴定[J].安徽农学通报，2011，17（23）43-45. （责编：徐世红）
关键词：三聚氰胺；人工抗原；ELISA
中图分类号 S13 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）10-19-03
三聚氰胺（Melamine），IUPAC命名为“1，3，5-三嗪-2，4，6-三氨基”，化学式为C3H6N6[1]。18世纪以来，三聚氰胺已经被作为一种重要的工业原材料在使用，因其含氮量高被作为庄稼的肥料[2]，被作为耐火材料添加到油漆、塑料盒纸张、建筑中[3，4]。从其化学式看出15个原子中，含有6个氮原子，氮含量达66.67%左右[5]，常被作为伪劣的高蛋白掺杂在牛奶、食品、饲料中[6，7]，造成蛋白质含量虚高的假象[8]。本实验主要合成具有活性的三聚氰胺人工抗原，用竞争结合实验验证了三聚氰胺人工抗原合成成功，旨在为制备三聚氰胺抗体和三聚氰胺ELISA试剂盒奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 三聚氰胺，纯度99.5%，购于天津光复精细化工研究所；牛血清白蛋白，购买于厦门市科展；三聚氰胺抗体，本实验室之前已合成。
1.1.2 实验仪器 KHB ST-360酶标仪，上海科华实验系统有限公司制造；离心机，法国thermo tlectron industries sas 制造；KQ-500DE数控超声波，舒美昆山市超声仪器有限公司；UVmini-1240紫外可见分光光度计。
1.2 三聚氰胺人工抗原的合成 参照董国伟等的文献[9]准确称取10mg（0.07mmol）三聚氰胺（MEL）、150mg（0.002mmol）牛血清白蛋白（BSA）、50mg的EDC，分别溶于1mL丙三醇、3mL和3mL PBS中，漩涡混匀。4℃冰浴下避光搅拌反应4h，再向混合溶液中滴加剩下的1mL EDC溶液，继续冰浴下反应24h，以4 000r/min离心3min取上清液装入透析袋，于0.01mol/L、pH7.4的PBS中4℃定时透析3d，留部分进行鉴定，试管分装并进行冷冻真空干燥，合成物于-20℃条件下冷冻保存。
1.3 人工抗原结构鉴定 在本实验紫外测试OD值的范围内，确定3种物质浓度的条件下，三聚氰胺和牛血清白蛋白均有各自不同的紫外特征吸收峰。根据比尔定律可知，物质对光的吸收即OD值与该物质的浓度有一定的比例关系可推算出偶联比计算公式如下[10]：
偶联比=[（OD偶-OD载）×ρ半抗原×M载OD半抗原×M半抗原×ρ载×ρ偶] （1）
1.4 酶标抗原的合成
1.4.1 过碘酸钠法合成三聚氰胺酶标抗原 将10mg辣根过氧化物酶（HRP）溶于2mL超纯水，滴加0.4mL新配的0.1mol/L NaIO4，漩涡混匀。滴加0.4mL新配的0.2mol/L乙二醇，漩涡混匀。用0.001mol/L、pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析9h，恢复室温混匀，将活化的HRP溶液逐滴加到用2mL CBS包被液溶解的冷冻干燥的5mg MEL-BSA溶液中。室温避光磁力搅拌30min，用2mol/L NaOH调pH值到 9.5，避光搅拌1h。加入0.2mL用超纯水新配的4mg/mL NaBH4，4℃反应2h。用PBS充分透析，于-20℃下分装进行保存[11]。
1.4.2 戊二醛交联法 将10mg HRP溶于0.2mL含1.25%戊二醛的pH6.8、0.1mol/L PBS中，放置室温18h，充分透析，记录时间，以除去多余的戊二醛。加生理盐水至1mL然后加5mg纯化的抗原及其0.1mL、pH9.6的1mol/L碳酸盐缓冲液，混合于4℃冰箱放置24h，加入0.1mL、0.2mol/L赖氨酸溶液，室温放置2h。用PBS充分透析，离心除沉淀，上清即为酶结合物。
1.5 紫外鉴定 将MEL-BSA-HRP、HRP、MEL-BSA均用PBS配成0.5mg/mL的溶液，用PBS调零，在200～500nm波长范围内进行扫描吸收曲线并且加以比较。
1.6 直接竞争ELISA法鉴定人工抗原及酶标抗原合成 第一步包被抗体： 用0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲溶液（简称CBS）稀释抗体稀释成不同浓度，用移液枪滴加酶标板上，37℃包被2h。第二步封闭：取出将包被好的酶标板，待其恢复至室温后，用洗涤缓冲液洗涤。加1%BSA-PBS 300μL/每孔封闭，置于37℃水浴恒温箱中温育30min，也可以室温避光封闭1h，必须严格控制封闭时间。第三步酶标抗原： 将封闭好的酶标板取出，待其恢复至室温后，甩去包被液，用洗涤缓冲溶液洗涤后，依次加入用PBS稀释的酶标抗原（从100倍起，对倍稀释）100μL/孔，每个浓度重复3孔，以PBST为空白对照，置于37℃水浴恒温箱中温育1h。第四步加底物： 将加入酶标抗体的酶标板取出，待其恢复至室温，用洗涤缓冲溶液洗涤后，加TMB液100μL/孔，置于37℃恒温箱中15min。现象由无色变为蓝色。第五步终止反应： 取出酶标板，直接加入2mol/L硫酸50μL/孔，反应液从黄色变成棕色。
测定：用酶标仪测定终止反应后的酶标板的OD450值。以OD450值接近1.0时的酶标抗体稀释后的浓度为其效价，并根据其效价。
2 结果与分析
2.1 人工抗原合成紫外扫描结果 从图1中可以看出三聚氰胺的特征峰在219nm附近，牛血清白蛋白在228nm和278nm附近均有吸收峰，人工抗原MEL-BSA在225nm和266nm附近均有吸收峰。MEL-BSA保留了牛血清白蛋白在228处最大吸收峰并且发生了偏移。偶联物MEL-BSA在266nm附近有吸收峰与龚云飞等[12]写的三聚氰胺人工抗原及多克隆抗体的制备报道的一致。 2.2 人工抗原偶联比 本实验制备的三聚氰胺人工免疫原，在波长位241nm处，半抗原、载体蛋白、偶联物均有较强的紫外吸收，根据公式（1）可计算得出半抗原与载体蛋白偶联比为29.35：1，偶联比较高。
2.3 酶标抗原合成紫外扫描结果 由图2可知，反应产物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的叠加，说明反应产物是MEL-BSA和HRP的结合物，表明偶联成功，酶标抗原合成成功。
由图3可知，反应产物的吸收峰是MEL-BSA和HRP吸收峰的叠加，说明反应产物是MEL-BSA和HRP的结合物，表明偶联成功，酶标抗原合成成功。
由图2和图3比较可以看出，戊二醛交联法吸收峰的叠加主要在200～300nm区间，而辣根过氧化物的吸收峰在350～450的区间范围内，而戊二醛交联法的吸收峰明显高于HRP可能是造成了HRP之间的交联。所以采用改良的过碘酸钠法来酶标抗原效果比戊二醛法交联法好。
2.4 固相抗原-酶标抗体棋盘滴定法数据 由表1可以看出抗原的浓度为1：3 200，抗体的浓度为1：8 000时，酶标仪的数据为1.028，此位置抗原和抗体消耗的量均少，效果又好，表明三聚氰胺人工抗原合成成功。
3 讨论
本实验通过紫外鉴定和三聚氰胺抗原抗体的竞争结合实验来直接证明三聚氰胺人工抗原是否合成，能够在短时间内进行验证，由于抗体合成时间较长（1～2月），利用本实验室之前合成好的三聚氰胺抗体进行验证，三聚氰胺半抗原的偶联比为29.35：1，说明三聚氰胺结合在牛血清白蛋白上的数量大，所携带的抗原决定簇多，容易刺激机体产生特异性抗体。接下来可进行三聚氰胺抗体的合成，并为三聚氰胺ELISA试剂盒的研制提供了基础。
参考文献
[1]李项华.问题奶粉罪魁祸首——三聚氰胺[J].中国计量，2008，10（2）42-43.
[2]R.D. Hauck，H.F. Stephenson. Fertilizer Nitrogen Sources 12，1964：147.
[3]Ashford’s Dictionary of Industrial Chemicals[M].3rd edn. ISBN： 978-0-9522674-3-0，2011：5 713.
[4]Bizzari S，Yokose K.Melamine. In： Chemical economics handbook[M].Menlo Park，CA，SRI Consulting，Inc， 2008.
[5]王永占，赵艳平，刘天阳.第三代气相萃冷三聚氰胺生产工艺[J].石油和化工节能，2011，3（4）15-18.
[6]Wang JB，Ndong M，Kai H，Matsuno K，Kayama F.Placental transfer of melamine and its effects on rat dams andfetuses[J].Food Chem Toxicol，2010，48：1791.
[7]Squadrone S，Ferro GL，Marchis D，Mauro C，Palmegiano P，AmatoG，Poma Genin E，Abete MC. Determination of melamine infeed： Validation of a gas chromatography–mass spectrometry method according to 2004/882/CE regulation[J].Food Control，2010，21：714.
[8]薛树科，宋金凤，时丽艳，等.乳制品中三聚氰胺检测研究进展[J].河北化工，2010，33（9）：21-23.
[9]董国伟，王末，刘贤进，等.兔抗甲胺磷多克隆抗体的制备[J].华中农业大学学报，2001，20（4）：340-343.
[10]李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析[M].上海：上海科学技术出版社，2002.
[11]张道宏，石德时，毕丁仁.氯霉素检测试剂盒的初步评价及鉴定[D].武汉：华中农业大学，2007.
[12]王旻子，应永飞，龚云飞，等.三聚氰胺人工抗原的合成与鉴定[J].安徽农学通报，2011，17（23）43-45. （责编：徐世红）