【摘 要】
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目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达. 方法 根据pcD-NA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进
【机 构】
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山东省医学科学院,山东省寄生虫病防治研究所,山东济宁272033
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目的 构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体并进行293T细胞的转染表达. 方法 根据pcD-NA3-HBsAg-p30-ROP2重组质粒设计引物,进行PCR扩增,获得HBsAg-p30-ROP2融合基因并进行酶切,酶切片段与pEGFP-N1载体连接,构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2真核表达载体,酶切和测序鉴定后转染293T细胞,采用荧光、Western blot和ELISA检测其蛋白表达效率;分别用P30单抗腹水、ROP2鼠源多抗、乙肝患者血清进行ELISA,检测融合蛋白的免疫反应性. 结果 PCR扩增HBsAg-p30-ROP2基因片段约2 600 bp,与理论值相符.构建的重组质粒pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2经双酶切获到约4 700 bp和约2 600 bp的两条片段,与预期相符.对重组载体测序,HBsAg基因的252位C→A,345位T→C,ROP2基因的695位A→T,且3个碱基突变均为同义突变.免疫荧光法检测pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2转染成功并正确表达,细胞蛋白浓度2.40 mg/ml.提取的融合蛋白能被弓形虫p30单抗腹水、ROP2鼠源多抗和乙肝患者血清识别. 结论 成功构建pEGFP-N1-HBsAg-p30-ROP2重组表达载体,并在293T细胞中过表达,表达蛋白具有免疫反应性,为乙肝和弓形虫联合疫苗的研制奠定了基础.
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