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【摘要】目的:探讨倍他福林(Betaphrine)对地塞米松诱导大鼠的胰岛素抵抗作用及其机制。方法:隔日肌肉注射地塞米松1mg/kg,共3周,复制胰岛素抵抗模型,同时用不同剂量的倍他福林(7,20,60 mg/kg)干预。测定血清中葡萄糖,甘油三酯,胰岛素的量,用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达。 结果:与正常对照组相比,模型组大鼠空腹血糖,甘油三酯,胰岛素升高。与模型组相比,倍他福林作用组大鼠空腹血糖,甘油三酯,胰岛素下降,肝脏葡萄糖转运蛋白-4的表达增加。结论:倍他福林可改善大鼠胰岛素抵抗模型胰岛素抵抗性。
关键词:倍他福林;胰岛素抵抗;地塞米松
中图分类号:R965 文献标识码:B文献编号:1671-4954(2010)10-698-03
Doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.10.002
随着我国肥胖和糖尿病发病率的不断增加,对于其发病机制的研究也日益加深,胰岛素抵抗是2型糖尿病的显著特征。大量前沿研究已证实,β3肾上腺素能受体激动剂在体内作用广泛。与机体的许多生理功能及疾病的发生关系密切。近年来,关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。本实验旨在通过观察胰岛素抵抗大鼠经β3肾上腺素能受体激动剂倍他福林干预后,其空腹血糖,甘油三酯,胰岛素水平,以探讨倍他福林对大鼠胰岛素抵抗的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器:倍他福林和盐酸吡格列酮均由重庆医药工业研究院提供,地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司),葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司),甘油三酯试剂盒(长春汇力生物技术有限公司),胰岛素测定试剂盒,葡萄糖转运蛋白-4抗体(北京博奥森生物技术有限公司),辣根酶标记的山羊抗兔的IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)内参β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.1.2 动物:清洁级wistar雄性大鼠48只及饲料,均由重庆医科大学动物中心提供,自由饮用食水。
1.2 方法
1.2.1胰岛素抵抗大鼠模型的复制
隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,复制胰岛素抵抗大鼠模型[1]。成模标准:空腹血糖大于或等于7.8mmol/L。
1.2.2 实验分组:共分6组,每组8只。
①正常对照组:(隔日肌注等体积的生理盐水,共3周)
②模型组:(隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,空腹血糖大于或等于7.8mmol/L)
③倍他福林低剂量组:(造模同时灌胃7mg/kg/d倍他福林,共3周)
④倍他福林中剂量组:(造模同时灌胃20mg/kg/d倍他福林,共3周)
⑤倍他福林高剂量组:(造模同时灌胃60mg/kg/d倍他福林,共3周)
⑥盐酸吡格列酮组: (造模同时灌胃20mg/kg/d盐酸吡格列酮,共3周)
1.2.3 标本的采集与处理
末次给药后禁食12小时,3.5%水合氯醛腹腔麻醉。股动脉取血于试管中,37度水浴静置30分钟,以3 500 r/min离心10 min,分离血清,于一70℃冰箱内保存以检测血糖,甘油三酯,胰岛素的含量。血糖,甘油三酯,胰岛素含量的检测按照试剂盒的说明操作。
1.2.4用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达
应用组织裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA法测定各组总蛋白浓度。分装,一80℃ 保存。各组样品分别取总蛋白30μg,加热变性,经10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭同时加GLUT-4多克隆的一抗(1:300),室温2小时。用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜(10min×3次),然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1000),室温孵育2小时,用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜(10min×3次),ECL化学发光发检测条带。β-actin作为内参。采用quantityone 图像分析系统采集图像并行半定量分析。
1.2.5 统计学分析
结果均以均数加减标准差(χ±s)表示,数据处理使用SPSS12.0统计软件进行单因素的方差分析,P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 血糖,甘油三酯,胰岛素含量的测定
结果发现,倍他福林可以降低血清中的葡萄糖,甘油三酯,胰岛素的量,提示倍他福林可以改善胰岛素抵抗。2.2 westernblotting 方法测葡萄糖转运蛋白-4的表达
与空白对照组相比,模型组葡萄糖转运蛋白-4的表达减少。倍他福林可以增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,同吡格列酮的作用相当。(图 a 上方的条带是葡萄糖转运蛋白-4,下方的条带是内参β-actin)
3 讨论
IR是一种异常的病理生理状态,是许多临床疾病或病征,尤其是常见的内分泌代谢疾病,如糖尿病、肥胖症、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险因素[2]。大量研究表明,糖皮质激素地塞米松具有损伤胰岛素调节葡萄糖分布的能力,从而引起胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取、利用减少,导致胰岛素抵抗。本实验证明了地塞米松能引起大鼠产生胰岛素抵抗。其机制包括以下两方面:① 下调3T3一L1脂肪细胞中胰岛素受体底物(IRS)一1的表达,而IRS-1在与参与葡萄糖转运的葡萄糖转运(GLUT)4有关的磷脂酰肌醇一3激酶(PI3一K)的激活中起着重要作用;②地塞米松有可能直接损伤了GLUT4转运葡萄糖的能力[3]。
近年来,关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。Umekawa发现β3肾上腺受体激动剂 可提高白色脂肪组织和棕色脂肪组织中GLUT-4的水平,从而增加葡萄糖的摄取。Smith发现,用β3肾上腺受体激动剂BRL35135可选择性的减少内脏脂肪,降低外周组织的胰岛素抵抗,从而纠正糖耐量异常[4]。Darimont等发现,肥胖大鼠口服选择性的β3肾上腺受体激动剂ZD7114,可以抑制大鼠肌肉和脂肪组织中脂类的形成,从而改善胰岛素抵抗[5]。Yamamoto 等研究发现,选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175有降糖作用,可增加血浆胰岛素水平,此外还可以减少血浆甘油三酯和总胆固醇,抑制体重的增加,提示选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175治疗糖尿病和肥胖[6]。倍他福林是β3肾上腺受体激动剂,本实验结果提示倍他福林可以降低胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖,甘油三酯,胰岛素水平,增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,从而改善胰岛素抵抗。
综上所述,隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,可以成功的复制胰岛素抵抗大鼠模型。倍他福林在一定程度上可以改善胰岛素抵抗。倍他福林改善胰岛素抵抗可能是增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,其确切机制有待于进一步的研究。
【参考文献】
[1] 佟春玲,高群杰,金玉珍,等.地塞米松诱导大
鼠胰岛素抵抗机制的形态学研究[J].黑龙江医药
科学,2001,24(5):100-101.
[2] 谭海荣,潘竞锵,韩超,等.茵陈蒿汤改善地塞
米松致大鼠胰岛素抵抗作用的实验研究[J].广东
药学,2002,12(5):46-48.
[3] 白红艳,邹文俊,高小平,等.葛根对地塞米
松诱导的胰岛素抵抗的影响[J].中国中药杂志,
2004,29(4):356-358.
[4] 王维敏,马向华,陈家伟.β3肾上腺素能受体
激动剂在减重外的其他作用[J].医学综述,
2003,9(4):246-248.
[5] Darimont C,Turini M, Epitaux M,et al.beta3-
adrenoceptor agonist prevents alterations of muscle
diacylglycerol and adipose tissue phospholipids
induced by a cafeteria diet[J].Nutr Metab (Lond),
2004,Aug 17,1(1):4.
[6] Yamamoto H,Takakura S,Yamamoto T,et
al.FR149175,a beta 3-adrenoceptor-selective
agonist,is a possible therapeutic agent for
non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Jpn J
Pharmacol,1997 May,74(1):109-12.
关键词:倍他福林;胰岛素抵抗;地塞米松
中图分类号:R965 文献标识码:B文献编号:1671-4954(2010)10-698-03
Doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.10.002
随着我国肥胖和糖尿病发病率的不断增加,对于其发病机制的研究也日益加深,胰岛素抵抗是2型糖尿病的显著特征。大量前沿研究已证实,β3肾上腺素能受体激动剂在体内作用广泛。与机体的许多生理功能及疾病的发生关系密切。近年来,关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。本实验旨在通过观察胰岛素抵抗大鼠经β3肾上腺素能受体激动剂倍他福林干预后,其空腹血糖,甘油三酯,胰岛素水平,以探讨倍他福林对大鼠胰岛素抵抗的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器:倍他福林和盐酸吡格列酮均由重庆医药工业研究院提供,地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司),葡萄糖试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司),甘油三酯试剂盒(长春汇力生物技术有限公司),胰岛素测定试剂盒,葡萄糖转运蛋白-4抗体(北京博奥森生物技术有限公司),辣根酶标记的山羊抗兔的IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)内参β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.1.2 动物:清洁级wistar雄性大鼠48只及饲料,均由重庆医科大学动物中心提供,自由饮用食水。
1.2 方法
1.2.1胰岛素抵抗大鼠模型的复制
隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,复制胰岛素抵抗大鼠模型[1]。成模标准:空腹血糖大于或等于7.8mmol/L。
1.2.2 实验分组:共分6组,每组8只。
①正常对照组:(隔日肌注等体积的生理盐水,共3周)
②模型组:(隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,空腹血糖大于或等于7.8mmol/L)
③倍他福林低剂量组:(造模同时灌胃7mg/kg/d倍他福林,共3周)
④倍他福林中剂量组:(造模同时灌胃20mg/kg/d倍他福林,共3周)
⑤倍他福林高剂量组:(造模同时灌胃60mg/kg/d倍他福林,共3周)
⑥盐酸吡格列酮组: (造模同时灌胃20mg/kg/d盐酸吡格列酮,共3周)
1.2.3 标本的采集与处理
末次给药后禁食12小时,3.5%水合氯醛腹腔麻醉。股动脉取血于试管中,37度水浴静置30分钟,以3 500 r/min离心10 min,分离血清,于一70℃冰箱内保存以检测血糖,甘油三酯,胰岛素的含量。血糖,甘油三酯,胰岛素含量的检测按照试剂盒的说明操作。
1.2.4用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达
应用组织裂解液提取各组细胞总蛋白,BCA法测定各组总蛋白浓度。分装,一80℃ 保存。各组样品分别取总蛋白30μg,加热变性,经10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭同时加GLUT-4多克隆的一抗(1:300),室温2小时。用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜(10min×3次),然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1000),室温孵育2小时,用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜(10min×3次),ECL化学发光发检测条带。β-actin作为内参。采用quantityone 图像分析系统采集图像并行半定量分析。
1.2.5 统计学分析
结果均以均数加减标准差(χ±s)表示,数据处理使用SPSS12.0统计软件进行单因素的方差分析,P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 血糖,甘油三酯,胰岛素含量的测定
结果发现,倍他福林可以降低血清中的葡萄糖,甘油三酯,胰岛素的量,提示倍他福林可以改善胰岛素抵抗。2.2 westernblotting 方法测葡萄糖转运蛋白-4的表达
与空白对照组相比,模型组葡萄糖转运蛋白-4的表达减少。倍他福林可以增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,同吡格列酮的作用相当。(图 a 上方的条带是葡萄糖转运蛋白-4,下方的条带是内参β-actin)
3 讨论
IR是一种异常的病理生理状态,是许多临床疾病或病征,尤其是常见的内分泌代谢疾病,如糖尿病、肥胖症、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险因素[2]。大量研究表明,糖皮质激素地塞米松具有损伤胰岛素调节葡萄糖分布的能力,从而引起胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取、利用减少,导致胰岛素抵抗。本实验证明了地塞米松能引起大鼠产生胰岛素抵抗。其机制包括以下两方面:① 下调3T3一L1脂肪细胞中胰岛素受体底物(IRS)一1的表达,而IRS-1在与参与葡萄糖转运的葡萄糖转运(GLUT)4有关的磷脂酰肌醇一3激酶(PI3一K)的激活中起着重要作用;②地塞米松有可能直接损伤了GLUT4转运葡萄糖的能力[3]。
近年来,关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。Umekawa发现β3肾上腺受体激动剂 可提高白色脂肪组织和棕色脂肪组织中GLUT-4的水平,从而增加葡萄糖的摄取。Smith发现,用β3肾上腺受体激动剂BRL35135可选择性的减少内脏脂肪,降低外周组织的胰岛素抵抗,从而纠正糖耐量异常[4]。Darimont等发现,肥胖大鼠口服选择性的β3肾上腺受体激动剂ZD7114,可以抑制大鼠肌肉和脂肪组织中脂类的形成,从而改善胰岛素抵抗[5]。Yamamoto 等研究发现,选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175有降糖作用,可增加血浆胰岛素水平,此外还可以减少血浆甘油三酯和总胆固醇,抑制体重的增加,提示选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175治疗糖尿病和肥胖[6]。倍他福林是β3肾上腺受体激动剂,本实验结果提示倍他福林可以降低胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖,甘油三酯,胰岛素水平,增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,从而改善胰岛素抵抗。
综上所述,隔日肌注地塞米松1mg/kg,共3周,可以成功的复制胰岛素抵抗大鼠模型。倍他福林在一定程度上可以改善胰岛素抵抗。倍他福林改善胰岛素抵抗可能是增加葡萄糖转运蛋白-4的表达,其确切机制有待于进一步的研究。
【参考文献】
[1] 佟春玲,高群杰,金玉珍,等.地塞米松诱导大
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[2] 谭海荣,潘竞锵,韩超,等.茵陈蒿汤改善地塞
米松致大鼠胰岛素抵抗作用的实验研究[J].广东
药学,2002,12(5):46-48.
[3] 白红艳,邹文俊,高小平,等.葛根对地塞米
松诱导的胰岛素抵抗的影响[J].中国中药杂志,
2004,29(4):356-358.
[4] 王维敏,马向华,陈家伟.β3肾上腺素能受体
激动剂在减重外的其他作用[J].医学综述,
2003,9(4):246-248.
[5] Darimont C,Turini M, Epitaux M,et al.beta3-
adrenoceptor agonist prevents alterations of muscle
diacylglycerol and adipose tissue phospholipids
induced by a cafeteria diet[J].Nutr Metab (Lond),
2004,Aug 17,1(1):4.
[6] Yamamoto H,Takakura S,Yamamoto T,et
al.FR149175,a beta 3-adrenoceptor-selective
agonist,is a possible therapeutic agent for
non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Jpn J
Pharmacol,1997 May,74(1):109-12.