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【摘要】目的：探讨倍他福林（Betaphrine）对地塞米松诱导大鼠的胰岛素抵抗作用及其机制。方法：隔日肌肉注射地塞米松1mg/kg，共3周，复制胰岛素抵抗模型，同时用不同剂量的倍他福林（7，20，60 mg/kg）干预。测定血清中葡萄糖，甘油三酯，胰岛素的量，用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达。 结果：与正常对照组相比，模型组大鼠空腹血糖，甘油三酯，胰岛素升高。与模型组相比，倍他福林作用组大鼠空腹血糖，甘油三酯，胰岛素下降，肝脏葡萄糖转运蛋白-4的表达增加。结论：倍他福林可改善大鼠胰岛素抵抗模型胰岛素抵抗性。
关键词：倍他福林；胰岛素抵抗；地塞米松
中图分类号：R965 文献标识码：B文献编号：1671-4954（2010）10-698-03
Doi：10.3969/j.issn.1671-4954.2010.10.002
随着我国肥胖和糖尿病发病率的不断增加，对于其发病机制的研究也日益加深，胰岛素抵抗是2型糖尿病的显著特征。大量前沿研究已证实，β3肾上腺素能受体激动剂在体内作用广泛。与机体的许多生理功能及疾病的发生关系密切。近年来，关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。本实验旨在通过观察胰岛素抵抗大鼠经β3肾上腺素能受体激动剂倍他福林干预后，其空腹血糖，甘油三酯，胰岛素水平，以探讨倍他福林对大鼠胰岛素抵抗的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器：倍他福林和盐酸吡格列酮均由重庆医药工业研究院提供，地塞米松磷酸钠注射液（湖北天药药业股份有限公司），葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），甘油三酯试剂盒（长春汇力生物技术有限公司），胰岛素测定试剂盒，葡萄糖转运蛋白-4抗体（北京博奥森生物技术有限公司），辣根酶标记的山羊抗兔的IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）内参β-actin（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.1.2 动物：清洁级wistar雄性大鼠48只及饲料，均由重庆医科大学动物中心提供，自由饮用食水。
1.2 方法
1.2.1胰岛素抵抗大鼠模型的复制
隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，复制胰岛素抵抗大鼠模型[1]。成模标准：空腹血糖大于或等于7.8mmol/L。
1.2.2 实验分组：共分6组，每组8只。
①正常对照组：（隔日肌注等体积的生理盐水，共3周）
②模型组：（隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，空腹血糖大于或等于7.8mmol/L）
③倍他福林低剂量组：（造模同时灌胃7mg/kg/d倍他福林，共3周）
④倍他福林中剂量组：（造模同时灌胃20mg/kg/d倍他福林，共3周）
⑤倍他福林高剂量组：（造模同时灌胃60mg/kg/d倍他福林，共3周）
⑥盐酸吡格列酮组： （造模同时灌胃20mg/kg/d盐酸吡格列酮，共3周）
1.2.3 标本的采集与处理
末次给药后禁食12小时，3.5％水合氯醛腹腔麻醉。股动脉取血于试管中，37度水浴静置30分钟，以3 500 r／min离心10 min，分离血清，于一70℃冰箱内保存以检测血糖，甘油三酯，胰岛素的含量。血糖，甘油三酯，胰岛素含量的检测按照试剂盒的说明操作。
1.2.4用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达
应用组织裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组总蛋白浓度。分装，一80℃ 保存。各组样品分别取总蛋白30μg，加热变性，经10％十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭同时加GLUT-4多克隆的一抗（1：300），室温2小时。用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜（10min×3次），然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1000），室温孵育2小时，用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜（10min×3次），ECL化学发光发检测条带。β-actin作为内参。采用quantityone 图像分析系统采集图像并行半定量分析。
1.2.5 统计学分析
结果均以均数加减标准差（χ±s）表示，数据处理使用SPSS12.0统计软件进行单因素的方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 血糖，甘油三酯，胰岛素含量的测定
结果发现，倍他福林可以降低血清中的葡萄糖，甘油三酯，胰岛素的量，提示倍他福林可以改善胰岛素抵抗。2.2 westernblotting 方法测葡萄糖转运蛋白-4的表达
与空白对照组相比，模型组葡萄糖转运蛋白-4的表达减少。倍他福林可以增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，同吡格列酮的作用相当。（图 a 上方的条带是葡萄糖转运蛋白-4，下方的条带是内参β-actin）
3 讨论
IR是一种异常的病理生理状态，是许多临床疾病或病征，尤其是常见的内分泌代谢疾病，如糖尿病、肥胖症、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险因素[2]。大量研究表明，糖皮质激素地塞米松具有损伤胰岛素调节葡萄糖分布的能力，从而引起胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取、利用减少，导致胰岛素抵抗。本实验证明了地塞米松能引起大鼠产生胰岛素抵抗。其机制包括以下两方面：① 下调3T3一L1脂肪细胞中胰岛素受体底物（IRS）一1的表达，而IRS-1在与参与葡萄糖转运的葡萄糖转运（GLUT）4有关的磷脂酰肌醇一3激酶（PI3一K）的激活中起着重要作用；②地塞米松有可能直接损伤了GLUT4转运葡萄糖的能力[3]。
近年来，关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。Umekawa发现β3肾上腺受体激动剂 可提高白色脂肪组织和棕色脂肪组织中GLUT-4的水平，从而增加葡萄糖的摄取。Smith发现，用β3肾上腺受体激动剂BRL35135可选择性的减少内脏脂肪，降低外周组织的胰岛素抵抗，从而纠正糖耐量异常[4]。Darimont等发现，肥胖大鼠口服选择性的β3肾上腺受体激动剂ZD7114，可以抑制大鼠肌肉和脂肪组织中脂类的形成，从而改善胰岛素抵抗[5]。Yamamoto 等研究发现，选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175有降糖作用，可增加血浆胰岛素水平，此外还可以减少血浆甘油三酯和总胆固醇，抑制体重的增加，提示选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175治疗糖尿病和肥胖[6]。倍他福林是β3肾上腺受体激动剂，本实验结果提示倍他福林可以降低胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖，甘油三酯，胰岛素水平，增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，从而改善胰岛素抵抗。
综上所述，隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，可以成功的复制胰岛素抵抗大鼠模型。倍他福林在一定程度上可以改善胰岛素抵抗。倍他福林改善胰岛素抵抗可能是增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，其确切机制有待于进一步的研究。
【参考文献】
[1] 佟春玲，高群杰，金玉珍，等.地塞米松诱导大
鼠胰岛素抵抗机制的形态学研究[J].黑龙江医药
科学，2001，24（5）：100-101.
[2] 谭海荣，潘竞锵，韩超，等.茵陈蒿汤改善地塞
米松致大鼠胰岛素抵抗作用的实验研究[J].广东
药学，2002，12（5）：46-48.
[3] 白红艳，邹文俊，高小平，等.葛根对地塞米
松诱导的胰岛素抵抗的影响[J].中国中药杂志，
2004，29（4）：356-358.
[4] 王维敏，马向华，陈家伟.β3肾上腺素能受体
激动剂在减重外的其他作用[J].医学综述，
2003，9（4）：246-248.
[5] Darimont C，Turini M， Epitaux M，et al.beta3-
adrenoceptor agonist prevents alterations of muscle
diacylglycerol and adipose tissue phospholipids
induced by a cafeteria diet[J].Nutr Metab （Lond），
2004，Aug 17，1（1）：4.
[6] Yamamoto H，Takakura S，Yamamoto T，et
al.FR149175，a beta 3-adrenoceptor-selective
agonist，is a possible therapeutic agent for
non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Jpn J
Pharmacol，1997 May，74（1）：109-12.
关键词：倍他福林；胰岛素抵抗；地塞米松
中图分类号：R965 文献标识码：B文献编号：1671-4954（2010）10-698-03
Doi：10.3969/j.issn.1671-4954.2010.10.002
随着我国肥胖和糖尿病发病率的不断增加，对于其发病机制的研究也日益加深，胰岛素抵抗是2型糖尿病的显著特征。大量前沿研究已证实，β3肾上腺素能受体激动剂在体内作用广泛。与机体的许多生理功能及疾病的发生关系密切。近年来，关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。本实验旨在通过观察胰岛素抵抗大鼠经β3肾上腺素能受体激动剂倍他福林干预后，其空腹血糖，甘油三酯，胰岛素水平，以探讨倍他福林对大鼠胰岛素抵抗的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂及仪器：倍他福林和盐酸吡格列酮均由重庆医药工业研究院提供，地塞米松磷酸钠注射液（湖北天药药业股份有限公司），葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），甘油三酯试剂盒（长春汇力生物技术有限公司），胰岛素测定试剂盒，葡萄糖转运蛋白-4抗体（北京博奥森生物技术有限公司），辣根酶标记的山羊抗兔的IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）内参β-actin（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.1.2 动物：清洁级wistar雄性大鼠48只及饲料，均由重庆医科大学动物中心提供，自由饮用食水。
1.2 方法
1.2.1胰岛素抵抗大鼠模型的复制
隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，复制胰岛素抵抗大鼠模型[1]。成模标准：空腹血糖大于或等于7.8mmol/L。
1.2.2 实验分组：共分6组，每组8只。
①正常对照组：（隔日肌注等体积的生理盐水，共3周）
②模型组：（隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，空腹血糖大于或等于7.8mmol/L）
③倍他福林低剂量组：（造模同时灌胃7mg/kg/d倍他福林，共3周）
④倍他福林中剂量组：（造模同时灌胃20mg/kg/d倍他福林，共3周）
⑤倍他福林高剂量组：（造模同时灌胃60mg/kg/d倍他福林，共3周）
⑥盐酸吡格列酮组： （造模同时灌胃20mg/kg/d盐酸吡格列酮，共3周）
1.2.3 标本的采集与处理
末次给药后禁食12小时，3.5％水合氯醛腹腔麻醉。股动脉取血于试管中，37度水浴静置30分钟，以3 500 r／min离心10 min，分离血清，于一70℃冰箱内保存以检测血糖，甘油三酯，胰岛素的含量。血糖，甘油三酯，胰岛素含量的检测按照试剂盒的说明操作。
1.2.4用westernblotting 法测定肝脏组织葡萄糖转运蛋白-4的表达
应用组织裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组总蛋白浓度。分装，一80℃ 保存。各组样品分别取总蛋白30μg，加热变性，经10％十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭同时加GLUT-4多克隆的一抗（1：300），室温2小时。用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜（10min×3次），然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1000），室温孵育2小时，用含吐温-20的TBST缓冲液洗膜（10min×3次），ECL化学发光发检测条带。β-actin作为内参。采用quantityone 图像分析系统采集图像并行半定量分析。
1.2.5 统计学分析
结果均以均数加减标准差（χ±s）表示，数据处理使用SPSS12.0统计软件进行单因素的方差分析，P＜0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 血糖，甘油三酯，胰岛素含量的测定
结果发现，倍他福林可以降低血清中的葡萄糖，甘油三酯，胰岛素的量，提示倍他福林可以改善胰岛素抵抗。2.2 westernblotting 方法测葡萄糖转运蛋白-4的表达
与空白对照组相比，模型组葡萄糖转运蛋白-4的表达减少。倍他福林可以增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，同吡格列酮的作用相当。（图 a 上方的条带是葡萄糖转运蛋白-4，下方的条带是内参β-actin）
3 讨论
IR是一种异常的病理生理状态，是许多临床疾病或病征，尤其是常见的内分泌代谢疾病，如糖尿病、肥胖症、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险因素[2]。大量研究表明，糖皮质激素地塞米松具有损伤胰岛素调节葡萄糖分布的能力，从而引起胰岛素靶组织对葡萄糖的摄取、利用减少，导致胰岛素抵抗。本实验证明了地塞米松能引起大鼠产生胰岛素抵抗。其机制包括以下两方面：① 下调3T3一L1脂肪细胞中胰岛素受体底物（IRS）一1的表达，而IRS-1在与参与葡萄糖转运的葡萄糖转运（GLUT）4有关的磷脂酰肌醇一3激酶（PI3一K）的激活中起着重要作用；②地塞米松有可能直接损伤了GLUT4转运葡萄糖的能力[3]。
近年来，关于β3肾上腺素能受体激动剂的抗糖尿病作用也有报道。Umekawa发现β3肾上腺受体激动剂 可提高白色脂肪组织和棕色脂肪组织中GLUT-4的水平，从而增加葡萄糖的摄取。Smith发现，用β3肾上腺受体激动剂BRL35135可选择性的减少内脏脂肪，降低外周组织的胰岛素抵抗，从而纠正糖耐量异常[4]。Darimont等发现，肥胖大鼠口服选择性的β3肾上腺受体激动剂ZD7114，可以抑制大鼠肌肉和脂肪组织中脂类的形成，从而改善胰岛素抵抗[5]。Yamamoto 等研究发现，选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175有降糖作用，可增加血浆胰岛素水平，此外还可以减少血浆甘油三酯和总胆固醇，抑制体重的增加，提示选择性的β3肾上腺受体激动剂FR149175治疗糖尿病和肥胖[6]。倍他福林是β3肾上腺受体激动剂，本实验结果提示倍他福林可以降低胰岛素抵抗大鼠的空腹血糖，甘油三酯，胰岛素水平，增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，从而改善胰岛素抵抗。
综上所述，隔日肌注地塞米松1mg/kg，共3周，可以成功的复制胰岛素抵抗大鼠模型。倍他福林在一定程度上可以改善胰岛素抵抗。倍他福林改善胰岛素抵抗可能是增加葡萄糖转运蛋白-4的表达，其确切机制有待于进一步的研究。
【参考文献】
[1] 佟春玲，高群杰，金玉珍，等.地塞米松诱导大
鼠胰岛素抵抗机制的形态学研究[J].黑龙江医药
科学，2001，24（5）：100-101.
[2] 谭海荣，潘竞锵，韩超，等.茵陈蒿汤改善地塞
米松致大鼠胰岛素抵抗作用的实验研究[J].广东
药学，2002，12（5）：46-48.
[3] 白红艳，邹文俊，高小平，等.葛根对地塞米
松诱导的胰岛素抵抗的影响[J].中国中药杂志，
2004，29（4）：356-358.
[4] 王维敏，马向华，陈家伟.β3肾上腺素能受体
激动剂在减重外的其他作用[J].医学综述，
2003，9（4）：246-248.
[5] Darimont C，Turini M， Epitaux M，et al.beta3-
adrenoceptor agonist prevents alterations of muscle
diacylglycerol and adipose tissue phospholipids
induced by a cafeteria diet[J].Nutr Metab （Lond），
2004，Aug 17，1（1）：4.
[6] Yamamoto H，Takakura S，Yamamoto T，et
al.FR149175，a beta 3-adrenoceptor-selective
agonist，is a possible therapeutic agent for
non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Jpn J
Pharmacol，1997 May，74（1）：109-12.