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摘 要：根据大蒜普通潜隐病毒(Gdrlic common latent virus，GCLV)的外壳蛋白区域的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物，以带毒植物的总RNA为模板，进行反转录和PCR扩增，通过反应体系和反应程序的建立与优化，扩增得到长300 bp的目的片段，并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆和序列测定。测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的序列同源性最高达98％。并对其检测的特异性和灵敏度进行了验证，从而建立了快速、灵敏、特异性强的GCLV分子生物学检测方法。
关键词：大蒜普通潜隐病毒；反转录－聚合酶链式反应；病毒检测
中图分类号：Q 814．9
大蒜为无性繁殖作物，病毒病危害相当严重，根据1989年walkey报道，感毒大蒜产量损失可达50％，且病毒一旦侵入很难脱除，常因鳞茎母体带毒而垂直传染给后代，引起种性退化而最终毁种。
黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所保存的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)、韭葱黄条病毒(LY-sV)、青葱潜隐病毒(SLV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)。将毒源接种于大蒜的繁殖寄主葱属植物上，置于温室中观察发病情况，经DAS-ELISA法检测病毒达到高峰期采收，保存于-80℃条件下备用。大肠杆菌(Escherichia coli)GM109由东北农业大学试验室提供，PMDl8-T购自TaKaRa(大连)公司。M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、EcoR I、sal I购自宝生物工程(大连)有限公司，dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司，B型质粒小样快速提取试剂盒、B型小量DNA片段快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。引物合成及序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成。
1．2 方法
1．2．1 GCLV特异性引物的设计
第1轮RT-PCR反转录体系：1.1 mmol／L的dNTP、2.5 μL的5×buffer、9.5U的RNasin、45.0U的RTase，总体积为10 μL，于42℃反应1 h；第2轮PCR反应体系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各22.0 ng、2.3 mmol／L的MgC12、0.2 mmol／L的dNTP、1.0I的TaqDNA聚合酶、2.3 μL的10×buffer，总体积为25 μL。PcR反应程序设置：94℃，5 min；然后94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min，反应35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用QIAEXⅡGel Exreaction Kit(QIAGEN)回收纯化。
1．2．4 目的基因的克隆与序列测定
将PcR扩增产物纯化后连接到PMD18-T Eas-y Vector上，转化到通过CaCl2法制备的GM109大肠杆菌感受态细胞中，挑取加有Amp的LB平板上的单菌落，应用B型质粒小样快速提取试剂盒提取质粒，利用Ecol I和Snz工对重组质粒进行双酶切鉴定。GCLV的目的片段委托上海生工生物工程有限公司进行测定。
2 结果与分析
2．1 GCLV总RNA的提取
要进行核酸杂交、RT-PCR等分子生物学研究，都必须有纯度较高、完整性较好的核酸。纯的核酸OD260 nm／OD280nm应大于1.700，表明植物组织中的酚类化合物、多糖和蛋白质等杂质抽提充分。本试验采用SDS法提取的植物总RNA，测得的OD260nm／OD280nm的值都在1.740以上，说明样品核酸提取的纯度及完整性均较好，见表1。
2．2 GCLV的RT-PCR初步扩增
以带毒植物的总RNA为模板，利用GCLV的特异性引物进行反转录及PCR扩增，得到了长度约为300 bp的目的片段与引物设计的片段大小一致，见图1。
2．3 GCLV的RT-PCR检测体系的优化 2．3．1 PCR部分引物用量的优化
为减少非特异性条带和降低试剂成本，对PCR部分的试剂用量进行了优化。
首先应用上述体系对引物用量在12.0～22.0 ng进行RT-PCR扩增效果比较，由图2可以看出，引物量在12.0 ng时引物二聚体基本消失，所以引物的最佳用量为12.0 ng。
为了进一步验证所扩增的目的片段，对其进行回收，经纯化后克隆到PMD18-T Easy Vector上，转人大肠杆菌，挑取LB平板上的单菌落，试剂盒提取质粒，最后双酶切验证得到了含有插入片段的重组子，见图5。
2．5 目的片段的序列测定及同源性比较
对重组质粒的插入片段进行了测序，结果得到了长度为300 bp的目的片段，样品的序列与GenBank中发表的GCLV分离物的相应区域基因序列进行比较，结果表明核苷酸序列同源性最高可达98％，最低为90％，氨基酸序列同源性最高可达97％，最低为91％，证明所克隆的片段为GCLV外壳蛋白保守序列的一部分。其中所测序列与GCLV引物设计序列(GenBank中的序列号：AB004804)相应区域的同源性为96％，比对结果见图6。
2．6 RT-PCR检测的特异性与灵敏度
2．6．1 RT-PCR检测的特异性
由于同属病毒之间及侵染同一植株的不同病毒之间的序列可能会存在一定的同源性，所以本试验对GCLV检测体系的特异性进行了验证，结果表明该体系对经常与GCLV复合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的阳性对照均不能得到扩增，表明GCLV检测体系的特异性较强。该检测体系的灵敏度为10-4病毒稀释液，相当于检测到100 ng感病组织中的GCLV，其灵敏度远远高于血清学检测，且可以在2 h内完成整个检测过程，这为大蒜脱毒苗的检测和大田病害的早期诊断提供了更加快速准确的检测方法。此检测体系也为进一步扩增病毒的基因组全序列，构建病毒的系统进化树及区分同属病毒不同种之间的差异和不同属病毒之间的关系奠定了基础。
关键词：大蒜普通潜隐病毒；反转录－聚合酶链式反应；病毒检测
中图分类号：Q 814．9
大蒜为无性繁殖作物，病毒病危害相当严重，根据1989年walkey报道，感毒大蒜产量损失可达50％，且病毒一旦侵入很难脱除，常因鳞茎母体带毒而垂直传染给后代，引起种性退化而最终毁种。
黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所保存的大蒜普通潜隐病毒(GCLV)、韭葱黄条病毒(LY-sV)、青葱潜隐病毒(SLV)、洋葱黄矮病毒(OYDV)。将毒源接种于大蒜的繁殖寄主葱属植物上，置于温室中观察发病情况，经DAS-ELISA法检测病毒达到高峰期采收，保存于-80℃条件下备用。大肠杆菌(Escherichia coli)GM109由东北农业大学试验室提供，PMDl8-T购自TaKaRa(大连)公司。M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、EcoR I、sal I购自宝生物工程(大连)有限公司，dNTP购自北京鼎国生物技术有限公司，B型质粒小样快速提取试剂盒、B型小量DNA片段快速回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。引物合成及序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成。
1．2 方法
1．2．1 GCLV特异性引物的设计
第1轮RT-PCR反转录体系：1.1 mmol／L的dNTP、2.5 μL的5×buffer、9.5U的RNasin、45.0U的RTase，总体积为10 μL，于42℃反应1 h；第2轮PCR反应体系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各22.0 ng、2.3 mmol／L的MgC12、0.2 mmol／L的dNTP、1.0I的TaqDNA聚合酶、2.3 μL的10×buffer，总体积为25 μL。PcR反应程序设置：94℃，5 min；然后94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1 min，反应35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用QIAEXⅡGel Exreaction Kit(QIAGEN)回收纯化。
1．2．4 目的基因的克隆与序列测定
将PcR扩增产物纯化后连接到PMD18-T Eas-y Vector上，转化到通过CaCl2法制备的GM109大肠杆菌感受态细胞中，挑取加有Amp的LB平板上的单菌落，应用B型质粒小样快速提取试剂盒提取质粒，利用Ecol I和Snz工对重组质粒进行双酶切鉴定。GCLV的目的片段委托上海生工生物工程有限公司进行测定。
2 结果与分析
2．1 GCLV总RNA的提取
要进行核酸杂交、RT-PCR等分子生物学研究，都必须有纯度较高、完整性较好的核酸。纯的核酸OD260 nm／OD280nm应大于1.700，表明植物组织中的酚类化合物、多糖和蛋白质等杂质抽提充分。本试验采用SDS法提取的植物总RNA，测得的OD260nm／OD280nm的值都在1.740以上，说明样品核酸提取的纯度及完整性均较好，见表1。
2．2 GCLV的RT-PCR初步扩增
以带毒植物的总RNA为模板，利用GCLV的特异性引物进行反转录及PCR扩增，得到了长度约为300 bp的目的片段与引物设计的片段大小一致，见图1。
2．3 GCLV的RT-PCR检测体系的优化 2．3．1 PCR部分引物用量的优化
为减少非特异性条带和降低试剂成本，对PCR部分的试剂用量进行了优化。
首先应用上述体系对引物用量在12.0～22.0 ng进行RT-PCR扩增效果比较，由图2可以看出，引物量在12.0 ng时引物二聚体基本消失，所以引物的最佳用量为12.0 ng。
为了进一步验证所扩增的目的片段，对其进行回收，经纯化后克隆到PMD18-T Easy Vector上，转人大肠杆菌，挑取LB平板上的单菌落，试剂盒提取质粒，最后双酶切验证得到了含有插入片段的重组子，见图5。
2．5 目的片段的序列测定及同源性比较
对重组质粒的插入片段进行了测序，结果得到了长度为300 bp的目的片段，样品的序列与GenBank中发表的GCLV分离物的相应区域基因序列进行比较，结果表明核苷酸序列同源性最高可达98％，最低为90％，氨基酸序列同源性最高可达97％，最低为91％，证明所克隆的片段为GCLV外壳蛋白保守序列的一部分。其中所测序列与GCLV引物设计序列(GenBank中的序列号：AB004804)相应区域的同源性为96％，比对结果见图6。
2．6 RT-PCR检测的特异性与灵敏度
2．6．1 RT-PCR检测的特异性
由于同属病毒之间及侵染同一植株的不同病毒之间的序列可能会存在一定的同源性，所以本试验对GCLV检测体系的特异性进行了验证，结果表明该体系对经常与GCLV复合侵染大蒜的LYSV、SLV、OYDV的阳性对照均不能得到扩增，表明GCLV检测体系的特异性较强。该检测体系的灵敏度为10-4病毒稀释液，相当于检测到100 ng感病组织中的GCLV，其灵敏度远远高于血清学检测，且可以在2 h内完成整个检测过程，这为大蒜脱毒苗的检测和大田病害的早期诊断提供了更加快速准确的检测方法。此检测体系也为进一步扩增病毒的基因组全序列，构建病毒的系统进化树及区分同属病毒不同种之间的差异和不同属病毒之间的关系奠定了基础。