【摘 要】
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目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测
【机 构】
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无锡海关(原无锡出入境检验检疫局); 南京海关(原江苏出入境检验检疫局);
【基金项目】
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江苏省自然科学基金青年基金项目(BK20161076);国家质检总局科技计划项目(2017IK225);海关总署应急技术保障专项(2018IK019)
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目的 建立基于颜色判定的适用于国境口岸简便、快速、灵敏和特异的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法检测人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)核酸。方法 通过序列比对,选择HCoV-OC43(Gen Bank号:KU131570)为参考株,根据其核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白基因保守区序列设计6条特异性引物,在65℃等温条件下扩增45min。在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。对病毒核酸依次倍比稀释以检验该方法的灵敏性;同时,对甲型、乙型流感病毒和其他HCoV进行检测,以检验该方法的特异性。结果 通过引物筛选最终选定了1组特异性引物,仅能与HCoV-OC43病毒核酸产生特异性反应并出现颜色改变,而与其他病毒均不能产生颜色变化,具有较高的特异性。与常规荧光定量RT-PCR法相比,该方法检测灵敏度达5.6拷贝/反应,灵敏度更高,且在短时间内达到对HCoV-OC43基因快速检测的目的。结论 建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-OC43病毒快速、灵敏、特异性检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。
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