论文部分内容阅读
摘要：以槭树品种“冷俊”为试材，利用RT-PCR技术，根据GenBank中登录的相关物种查尔酮异构酶基因（CHI）的保守序列设计简并引物，提取其秋季变色期叶片中的总RNA并扩增出CHI基因的cDNA片段。测序结果表明，该片段长553 bp，编码183个氨基酸。序列分析表明，该片段与龙眼、橄榄、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上，证明已成功克隆到槭树变色期叶片CHI基因的cDNA片段，在GenBank中登录号为KC121346。
关键词：槭树；CHI基因；克隆；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0012-04
1材料与方法
11材料
试验于2011年11月在山东省果树研究所观赏园艺室进行，以槭树品种“冷俊”的秋季变色叶片为试材。于11月份采集叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80℃冰箱中备用。
12试剂
PCR kit、cDNA kit购自大连宝生物工程公司，PCR引物合成及测序工作则由上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
13方法
131叶片总RNA提取参考招雪晴等[10]的方法，采用改良CTAB法提取槭树叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度计测量OD值。
反应条件：98℃变性30 s，然后按98℃ 10 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s进行35轮循环反应，最后72℃延伸6 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR产物送上海生工测序。
134序列分析通过BLASTN 进行同源性比对分析。用DNAMAN 60软件分析DNA 序列并进行多序列比对，翻译出氨基酸序列后在BLASTP中搜索相似性高的蛋白质序列。
2结果与分析
21槭树叶片总RNA的制备
利用改良的CTAB法提取槭树叶片的RNA，测量其OD值，结果为201，表明蛋白污染少。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，28S、18S条带较清晰，无降解，说明所提取的RNA纯度和完整性较好，无DNA污染，符合cDNA合成的要求。
22槭树叶片CHI基因片段的克隆与测序
利用设计好的简并引物，以槭树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，得到了与预计片段大小一致的片段（图1），测序后的cDNA片段为553 bp，编码183个氨基酸（图2）。
3结论与讨论
Druka 等[11]曾报道CHI cDNA序列的同源性一般为 42%～65%， 不同物种或同一物种不同类型的CHI也有较大的差异，给同源克隆CHI带来一定的困难。本试验表明，用于扩增的引物设计是同源克隆成功的重要因素，不合适的引物无扩增条带或产生弥散，而保守性好、GC含量高的引物克隆结果较好。故选择保守区间GC含量高的区域有利于同源克隆试验的成功。
目前研究结果表明，CHI是影响植物颜色形成的重要酶之一，会直接影响植物颜色表达。目前对CHI基因的研究主要在序列分析、基因克隆及转基因表达调控等方面。对CHIA和CHIB启动子DNA序列研究表明，启动子中有高度保守的序列37 bp[12]。菜豆和矮牵牛的氨基酸组成与从豌豆胚轴上克隆的CHI基因氨基酸序列显示较高的同源性[13]。现已在多种植物中克隆到CHI基因，并开始在转基因植物中应用。Muir等[1]曾将矮牵牛CHI基因转入番茄并获得了转基因番茄，结果显示番茄果皮中黄酮类含量增加了78倍，果肉中黄烷醇增加了21倍。将CHS和CHI基因导入矮牵牛，转基因植株花的颜色发生了改变，花器官也发生了变异[14]。洋葱中CHI基因突变引起CHI酶活性的丧失，导致洋葱变为金色[15]。对CHI基因的研究，前人大部分以蔬菜、水果、花卉等物种为试材，但对木本园林植物CHI基因的研究较少，本试验利用同源克隆的方法，首次以槭树为试材克隆出CHI基因cDNA片段，为下一步克隆槭树CHI基因cDNA全长奠定基础，该基因在槭树秋季变色过程中起何种调节作用，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] Muir S R， Collins G J， Robinson S， et al Overexpression of petunia chalcone is omerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J] Nature Biotechnology， 2001， 19： 470-474
[2]周发俊，王逸群，陈由强植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展（综述）[J] 河北科技师范学院学报，2008，22（1）：73-75
[3]Vantunen A J， Koes R E， Spelt C E， et al Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrid： coordinate， light-regulated and differential erpression of flavonoid genes[J] EMBO J， 1988， 7： 1257-1263
[4]Vantunen A J， Hartman S A， Mol J N Regulation of chalcone isomerase （CHI） gene expression in Petunia hydria： the use of alternative promoters in corolla， anthers and pollen[J] Plant MolBiol， 1989， 12： 539-551 [5]马春雷，赵丽萍，张亚丽，等 茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析[J]茶叶科学，2007，27（2）：127-132
[6]李军，李洪清，李美茹 大花美人蕉查尔酮异构酶基因的cDNA克隆和序列分析[J] 植物生理学通讯，2006，42（3）：449-453
[7]刘春霞，王玥，崔明昆，等 灯盏花CHI的克隆及其生物信息学分析[J] 武汉植物学研究，2010，28（6）：682-690
[8]孟庆法，田朝阳，高红莉，等 河南省槭树科植物资源及开发利用研究[J] 河南农业大学学报，2009，43（1）：65-69
[9]李倩中，苏家乐，陈尚平，等 三种槭树科植物光合特性日变化研究[J] 安徽农学通报，2007，13（6）：20-21
[10]招雪晴，苑兆和，陶吉寒，等 红花石榴二氢黄酮醇还原酶（DFR）基因cDNA片段克隆及序列分析[J] 山东农业科学，2012，44（2）：1-4
[11]Druka A， Kudrna D， Rostoks N， et al Chalcone isomerase gene from rice （Oryza sativa） and barley （Hordeum vulgare）： physical， genetic and mutation mapping[J] Gene，2003， 302（1-2）： 171-178
[12]Vandermeer I M， Sttam M E， Vantunen A J， et al Antisense inhibition of flavonoid biosynthesis in petunia anthers results in male sterility[J] Plant Cell，1992， 4： 253
[13]Wood A J， Davies E A cDNA encoding chalcone isomerase from aged pea epicotyls [J] Plant Physiol，1994， 104（4）： 1465-1466
[14]Pelletierm K， Burbulis I E， Winkle-shirley B Disruption of specific flavonoid genes enhances the accumulation of flavonoid enzymes and end-products in Arabidopsis seedlings [J] Plant MolBiol，1999， 4（1）： 45-54
[14]祝钦泷 转查尔酮异构酶（CHI）基因矮牵牛花色改变及其花器官变异的研究[D]重庆：西南农业大学， 2004
[15]Kim S， Jones R， Yoo K S， et al Gold color in onions （Allium cepa）： a natural mutation of the chalcone isomerase gene resulting in a premature stop codon [J] MolGenetGenomics， 2004， 72（4）： 411-419
关键词：槭树；CHI基因；克隆；序列分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）04-0012-04
1材料与方法
11材料
试验于2011年11月在山东省果树研究所观赏园艺室进行，以槭树品种“冷俊”的秋季变色叶片为试材。于11月份采集叶片，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室放入-80℃冰箱中备用。
12试剂
PCR kit、cDNA kit购自大连宝生物工程公司，PCR引物合成及测序工作则由上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
13方法
131叶片总RNA提取参考招雪晴等[10]的方法，采用改良CTAB法提取槭树叶片总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，采用Nanodrop紫外分光光度计测量OD值。
反应条件：98℃变性30 s，然后按98℃ 10 s、57℃ 25 s、72℃ 30 s进行35轮循环反应，最后72℃延伸6 min，4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。PCR产物送上海生工测序。
134序列分析通过BLASTN 进行同源性比对分析。用DNAMAN 60软件分析DNA 序列并进行多序列比对，翻译出氨基酸序列后在BLASTP中搜索相似性高的蛋白质序列。
2结果与分析
21槭树叶片总RNA的制备
利用改良的CTAB法提取槭树叶片的RNA，测量其OD值，结果为201，表明蛋白污染少。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，28S、18S条带较清晰，无降解，说明所提取的RNA纯度和完整性较好，无DNA污染，符合cDNA合成的要求。
22槭树叶片CHI基因片段的克隆与测序
利用设计好的简并引物，以槭树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，得到了与预计片段大小一致的片段（图1），测序后的cDNA片段为553 bp，编码183个氨基酸（图2）。
3结论与讨论
Druka 等[11]曾报道CHI cDNA序列的同源性一般为 42%～65%， 不同物种或同一物种不同类型的CHI也有较大的差异，给同源克隆CHI带来一定的困难。本试验表明，用于扩增的引物设计是同源克隆成功的重要因素，不合适的引物无扩增条带或产生弥散，而保守性好、GC含量高的引物克隆结果较好。故选择保守区间GC含量高的区域有利于同源克隆试验的成功。
目前研究结果表明，CHI是影响植物颜色形成的重要酶之一，会直接影响植物颜色表达。目前对CHI基因的研究主要在序列分析、基因克隆及转基因表达调控等方面。对CHIA和CHIB启动子DNA序列研究表明，启动子中有高度保守的序列37 bp[12]。菜豆和矮牵牛的氨基酸组成与从豌豆胚轴上克隆的CHI基因氨基酸序列显示较高的同源性[13]。现已在多种植物中克隆到CHI基因，并开始在转基因植物中应用。Muir等[1]曾将矮牵牛CHI基因转入番茄并获得了转基因番茄，结果显示番茄果皮中黄酮类含量增加了78倍，果肉中黄烷醇增加了21倍。将CHS和CHI基因导入矮牵牛，转基因植株花的颜色发生了改变，花器官也发生了变异[14]。洋葱中CHI基因突变引起CHI酶活性的丧失，导致洋葱变为金色[15]。对CHI基因的研究，前人大部分以蔬菜、水果、花卉等物种为试材，但对木本园林植物CHI基因的研究较少，本试验利用同源克隆的方法，首次以槭树为试材克隆出CHI基因cDNA片段，为下一步克隆槭树CHI基因cDNA全长奠定基础，该基因在槭树秋季变色过程中起何种调节作用，还有待于进一步研究。
参考文献：
[1] Muir S R， Collins G J， Robinson S， et al Overexpression of petunia chalcone is omerase in tomato results in fruit containing increased levels of flavonols[J] Nature Biotechnology， 2001， 19： 470-474
[2]周发俊，王逸群，陈由强植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展（综述）[J] 河北科技师范学院学报，2008，22（1）：73-75
[3]Vantunen A J， Koes R E， Spelt C E， et al Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrid： coordinate， light-regulated and differential erpression of flavonoid genes[J] EMBO J， 1988， 7： 1257-1263
[4]Vantunen A J， Hartman S A， Mol J N Regulation of chalcone isomerase （CHI） gene expression in Petunia hydria： the use of alternative promoters in corolla， anthers and pollen[J] Plant MolBiol， 1989， 12： 539-551 [5]马春雷，赵丽萍，张亚丽，等 茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析[J]茶叶科学，2007，27（2）：127-132
[6]李军，李洪清，李美茹 大花美人蕉查尔酮异构酶基因的cDNA克隆和序列分析[J] 植物生理学通讯，2006，42（3）：449-453
[7]刘春霞，王玥，崔明昆，等 灯盏花CHI的克隆及其生物信息学分析[J] 武汉植物学研究，2010，28（6）：682-690
[8]孟庆法，田朝阳，高红莉，等 河南省槭树科植物资源及开发利用研究[J] 河南农业大学学报，2009，43（1）：65-69
[9]李倩中，苏家乐，陈尚平，等 三种槭树科植物光合特性日变化研究[J] 安徽农学通报，2007，13（6）：20-21
[10]招雪晴，苑兆和，陶吉寒，等 红花石榴二氢黄酮醇还原酶（DFR）基因cDNA片段克隆及序列分析[J] 山东农业科学，2012，44（2）：1-4
[11]Druka A， Kudrna D， Rostoks N， et al Chalcone isomerase gene from rice （Oryza sativa） and barley （Hordeum vulgare）： physical， genetic and mutation mapping[J] Gene，2003， 302（1-2）： 171-178
[12]Vandermeer I M， Sttam M E， Vantunen A J， et al Antisense inhibition of flavonoid biosynthesis in petunia anthers results in male sterility[J] Plant Cell，1992， 4： 253
[13]Wood A J， Davies E A cDNA encoding chalcone isomerase from aged pea epicotyls [J] Plant Physiol，1994， 104（4）： 1465-1466
[14]Pelletierm K， Burbulis I E， Winkle-shirley B Disruption of specific flavonoid genes enhances the accumulation of flavonoid enzymes and end-products in Arabidopsis seedlings [J] Plant MolBiol，1999， 4（1）： 45-54
[14]祝钦泷 转查尔酮异构酶（CHI）基因矮牵牛花色改变及其花器官变异的研究[D]重庆：西南农业大学， 2004
[15]Kim S， Jones R， Yoo K S， et al Gold color in onions （Allium cepa）： a natural mutation of the chalcone isomerase gene resulting in a premature stop codon [J] MolGenetGenomics， 2004， 72（4）： 411-419