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[摘要]目的 研究microRNA-138在心力衰竭患者血清中的表达水平。方法 选择2015年1～3月朝阳市中心医院心内科住院的48例心力衰竭患者（心力衰竭组），病情严重程度按NYHA心功能分级分为Ⅱ～Ⅳ级，另外选取同期心内科住院的40例非心力衰竭患者（对照组），采用荧光定量PCR法测定血清microRNA-138的表达水平。符合Framingham心力衰竭诊断标准的患者均可人心力衰竭组。结果 心力衰竭患者血清microRNA-138表达水平较非心力衰竭患者升高，差异有统计学意义（P<0.05），且随NYHA心功能分级的增加而升高。将血清miR-138水平与临床常用心功能评估指标作相关性分析，结果显示，心力衰竭组患者血清miR-138水平与氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平呈正相关（P<0.05），与左室射血分数（LVEF）值呈负相关（P<0.01），miR-138诊断心力衰竭的ROC曲线下面积为0.81。结论 microRNA-138可作为诊断心力衰竭、危险分层、疗效及预后的一个客观生物标志物。
[关键词]microRNA-138；心力衰竭；血清
[中图分类号]R54 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）06-19-03
心力衰竭（HF）是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和（或）射血功能受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要，以肺循环和（或）体循环淤血，器官、组织血液灌注不足为临床表现的一组综合征。他是一种严重危害人们健康的疾病，是绝大多数心血管疾病的归结。心肌梗死、高血压、主动脉狭窄、瓣膜病变等心脏疾病都会造成血液动力学及神经内分泌的变化，而这些变化往往会引起心肌细胞内分子通路或转移通路的病理性变化，在压力负荷的作用下心脏往往表现为肥大，心肌重塑等改变。心脏重构是心力衰竭的基本机制，也是HF进展的病理生理学基础。随着对心衰发病机制认识的不断深入，人们发现microRNA在心力衰竭的病理生理中起至关重要的作用，在心力衰竭的确诊、病情及治疗效果的评估、预后方面均有重要价值。MicroRNA（miRNA）是一类约由19～25个核苷酸组成内源性非编码RNA。可通过序列特异性序列特异性的方式来调节特异基因的表达，其参与了细胞生长、分化、凋亡、代谢等几乎所有的生物过程。最近发现，microRNA稳定的存在于外周血中，可作为疾病的生物标志物。近年来多项研究已表明，心力衰竭中可以检测到多种miRNA水平的变化。本研究探讨心力衰竭患者与对照组非心力衰竭患者血清miRNA-138表达水平的差异。
1.资料与方法
1.1一般资料
选择2015年1～3月朝阳市中心医院心内科住院的50～75岁的48例心力衰竭患者为研究对象。各种原因导致心力衰竭并符合Framingham心力衰竭诊断标准的患者均可人心力衰竭组，其病情严重程度按纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准，其中NYHAⅡ、Ⅲ、Ⅳ级各16例；另选取非心力衰竭患者（对照组）为同期心内科的40例住院患者，既往无心力衰竭病史，临床资料检查无心力衰竭表现。Framingham诊断心力衰竭的主要标准为：阵发性夜间呼吸困难；颈静脉怒张；肺哕音；心脏扩大；急性肺水肿；第三心音奔马律；静脉压增高（>16cm H2O）。次要标准：踝部水肿；夜间咳嗽；活动后呼吸困难；肝肿大；胸腔积液，肺活量降低至最大肺活量的1/3；心动过速（>120次/min）。主要或次要标准包括：治疗5d以上时间后体质量减轻≥4.5kg。符合二项主要标准，或符合一项主要标准及二项次要标准者可确立诊断。纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准：I级体力活动不受，一般体力活动不引起过度的乏力、心悸或气促；Ⅱ级体力活动轻度受限，休息时无不适，日常活动量可致乏力、心悸或气促；Ⅲ级体力活动明显受限，休息时无不适，但低于日常活动即可引起上述症状；Ⅳ级不能无症状地进行任何体力活动，休息时可有症状，任何体力活动都加重不适。
1.2方法
入院次日晨空腹采肘正中静脉血，检查NT-proBNP、TNT、心肌酶、血常规、肝功能、肾功能、心脏彩色超声及射血分数，并留取5mL静脉血按照RNA提取试剂盒的说明离心取血清，储存于-80%冰箱中备用。血清microRNA-138的检测用实时PCR法检测提取的RNA的表达量。从留取的样本血清中提取富含miRNA的总RNA，在样品中加入5nmol/L的U6作为内参。用2（-△）方法得出miRNA的相对表达量，△Ct=Ctmax-Ctmax
1.3统计学处理
采用SPSS19.0软件，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，采用ROC曲线分析miR-138在心力衰竭中的诊断价值，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
心力衰竭组血清miR-138的相对表达量以及各临床生化指标，见表1，按不同NYHA心功能分级分别与对照组两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。正态分布资料间的相关性采用直线相关性分析，非正态分布资料间的相关性采用秩相关分析。
2.1不同NYHA分级组与对照组研究对象临床生化指标比较
与对照组比较，不同NYHA心功能分级的心力衰竭组患者的血清miR-138及NT-proBNP水平升高，LVEF降低，差异具有统计学意义（P<0.05），而WBC、ALT、Cr差异无统计学意义（P>0.05）c见表1。
2.2血清microRNA-138与研究对象的临床资料相关性分析
根据表2反映心力衰竭组血清microRNA-138与临床常用心功能评价指标LVEF及NT-proBNP的关系，与前者呈负相关，与后者呈正相关。
2.3 microRNA-138在心力衰竭中的诊断价值
根据ROC曲线，miR-138诊断心力衰竭的曲线下面积AUC为0.81（95%CI：0.68～0.92），可以提供中等的诊断参考价值。 3.讨论
2013年我国心血管病报告指出，35～74岁人群心力衰竭患病率为0.9%，随着年龄的增加，心力衰竭患病率迅速增加，尽管心力衰竭的治疗有了非常大的进展，但死亡数仍在迅速增加。随着对心衰发病机制认识的不断深入，生物标记物在心衰早期诊断、危险分层、预后评估及治疗策略方面的应用价值，已成为近年心血管疾病研究领域的热点之一。血清microRNA作为诊断和判断预后的分子标志物已越来越受到重视。有研究表明，micmRNA可稳定存在于外周血中，这是理想的疾病标记物的特征之一。Chen等报道，在将血清煮沸，或者加入强酸、强碱、RNA酶、DNA酶等多种恶劣情况下，血清中miRNA含量仍保持相对稳定。本研究正是基于microRNA的这个特征来研究miR-138与心力衰竭的关系。一些血清microRNA已被证明可以作为心血管疾病的分子标志物，如miR-1、miR-133a和miR-208a可作为急性心肌梗死患者的诊断标志物。现在大量的研究表明，miRNA与心脏疾病有着密切的相关性，2005年DRZhao首先发现miRNA-1-2特定性在心脏中存在并通过Hand2通道起作用，围绕miRNA的心脏作用的研究由此展开。迄今为止已发现miRNA在心肌肥大，心肌梗死后心律失常中起作用，并参与心肌的凋亡，其中miR-1、195、212、208、133等已经被证实通过不同的分子通路在上述的各个方面起作用。随着miRNA微阵列技术的发展，进一步证实多种miRNA参与了心脏病理性肥大及心力衰竭的发生。van Rooij等通过miRNAs微阵列技术检测发现在TAC（缩窄小鼠的主动脉弓诱导心肌肥大模型）小鼠及calcineurin蛋白转基因小鼠中，有21种miRNAs表达上调，7种miRNAs表达下调。
许多miRNA在心力衰竭心肌细胞凋亡、心室重构的信号转导过程中都有一定的调节作用，且心力衰竭患者中还可检测到一些miRNA水平的变化，miR-1、miR-29、miR-30、miR-133、miR-150、miR-7、miR-378等是下调的，而miR-23a、miR-125、miR-146、miR-195、miR-199、miR-214、miR-181b等是上调的，这些miRNA从分子机制上影响心力衰竭的发生、发展过程；在心衰早期，这四种miRNA的改变可引起信号通路紊乱。
本研究结果表明心力衰竭患者的血清miR-138表达水平较非心力衰竭者增高，不同NYHA分级心力衰竭组中血清miR-138水平较对照组高，且随NYHA心功能分级增加而升高，因miR-138是心肌肥大和心力衰竭的正性调节因子，当心力衰竭病情越严重时其心肌细胞中miR-138含量越高，释放进入外周血的量也随之增大，这可能是血清miR-138水平随NYHA分级增加而升高的原因之一。另外，miR-138与目前临床常用心功能评价指标具有较好的相关性，如与氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平呈正相关，与左室射血分数（LVEF）值呈负相关，提示miRNA-138可能参与了心力衰竭的病理生理过程，由衰竭的心肌细胞释放从而进入血液循环之中。其诊断心衰的ROC曲线下面积AUC为0.81，也说明对诊断有参考价值。综上所述血清microRNA-138水平可用作评价心力衰竭病情严重程度的一个客观生物标志物。
[关键词]microRNA-138；心力衰竭；血清
[中图分类号]R54 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）06-19-03
心力衰竭（HF）是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和（或）射血功能受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要，以肺循环和（或）体循环淤血，器官、组织血液灌注不足为临床表现的一组综合征。他是一种严重危害人们健康的疾病，是绝大多数心血管疾病的归结。心肌梗死、高血压、主动脉狭窄、瓣膜病变等心脏疾病都会造成血液动力学及神经内分泌的变化，而这些变化往往会引起心肌细胞内分子通路或转移通路的病理性变化，在压力负荷的作用下心脏往往表现为肥大，心肌重塑等改变。心脏重构是心力衰竭的基本机制，也是HF进展的病理生理学基础。随着对心衰发病机制认识的不断深入，人们发现microRNA在心力衰竭的病理生理中起至关重要的作用，在心力衰竭的确诊、病情及治疗效果的评估、预后方面均有重要价值。MicroRNA（miRNA）是一类约由19～25个核苷酸组成内源性非编码RNA。可通过序列特异性序列特异性的方式来调节特异基因的表达，其参与了细胞生长、分化、凋亡、代谢等几乎所有的生物过程。最近发现，microRNA稳定的存在于外周血中，可作为疾病的生物标志物。近年来多项研究已表明，心力衰竭中可以检测到多种miRNA水平的变化。本研究探讨心力衰竭患者与对照组非心力衰竭患者血清miRNA-138表达水平的差异。
1.资料与方法
1.1一般资料
选择2015年1～3月朝阳市中心医院心内科住院的50～75岁的48例心力衰竭患者为研究对象。各种原因导致心力衰竭并符合Framingham心力衰竭诊断标准的患者均可人心力衰竭组，其病情严重程度按纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准，其中NYHAⅡ、Ⅲ、Ⅳ级各16例；另选取非心力衰竭患者（对照组）为同期心内科的40例住院患者，既往无心力衰竭病史，临床资料检查无心力衰竭表现。Framingham诊断心力衰竭的主要标准为：阵发性夜间呼吸困难；颈静脉怒张；肺哕音；心脏扩大；急性肺水肿；第三心音奔马律；静脉压增高（>16cm H2O）。次要标准：踝部水肿；夜间咳嗽；活动后呼吸困难；肝肿大；胸腔积液，肺活量降低至最大肺活量的1/3；心动过速（>120次/min）。主要或次要标准包括：治疗5d以上时间后体质量减轻≥4.5kg。符合二项主要标准，或符合一项主要标准及二项次要标准者可确立诊断。纽约心脏学会（NYHA）心功能分级标准：I级体力活动不受，一般体力活动不引起过度的乏力、心悸或气促；Ⅱ级体力活动轻度受限，休息时无不适，日常活动量可致乏力、心悸或气促；Ⅲ级体力活动明显受限，休息时无不适，但低于日常活动即可引起上述症状；Ⅳ级不能无症状地进行任何体力活动，休息时可有症状，任何体力活动都加重不适。
1.2方法
入院次日晨空腹采肘正中静脉血，检查NT-proBNP、TNT、心肌酶、血常规、肝功能、肾功能、心脏彩色超声及射血分数，并留取5mL静脉血按照RNA提取试剂盒的说明离心取血清，储存于-80%冰箱中备用。血清microRNA-138的检测用实时PCR法检测提取的RNA的表达量。从留取的样本血清中提取富含miRNA的总RNA，在样品中加入5nmol/L的U6作为内参。用2（-△）方法得出miRNA的相对表达量，△Ct=Ctmax-Ctmax
1.3统计学处理
采用SPSS19.0软件，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，采用ROC曲线分析miR-138在心力衰竭中的诊断价值，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
心力衰竭组血清miR-138的相对表达量以及各临床生化指标，见表1，按不同NYHA心功能分级分别与对照组两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。正态分布资料间的相关性采用直线相关性分析，非正态分布资料间的相关性采用秩相关分析。
2.1不同NYHA分级组与对照组研究对象临床生化指标比较
与对照组比较，不同NYHA心功能分级的心力衰竭组患者的血清miR-138及NT-proBNP水平升高，LVEF降低，差异具有统计学意义（P<0.05），而WBC、ALT、Cr差异无统计学意义（P>0.05）c见表1。
2.2血清microRNA-138与研究对象的临床资料相关性分析
根据表2反映心力衰竭组血清microRNA-138与临床常用心功能评价指标LVEF及NT-proBNP的关系，与前者呈负相关，与后者呈正相关。
2.3 microRNA-138在心力衰竭中的诊断价值
根据ROC曲线，miR-138诊断心力衰竭的曲线下面积AUC为0.81（95%CI：0.68～0.92），可以提供中等的诊断参考价值。 3.讨论
2013年我国心血管病报告指出，35～74岁人群心力衰竭患病率为0.9%，随着年龄的增加，心力衰竭患病率迅速增加，尽管心力衰竭的治疗有了非常大的进展，但死亡数仍在迅速增加。随着对心衰发病机制认识的不断深入，生物标记物在心衰早期诊断、危险分层、预后评估及治疗策略方面的应用价值，已成为近年心血管疾病研究领域的热点之一。血清microRNA作为诊断和判断预后的分子标志物已越来越受到重视。有研究表明，micmRNA可稳定存在于外周血中，这是理想的疾病标记物的特征之一。Chen等报道，在将血清煮沸，或者加入强酸、强碱、RNA酶、DNA酶等多种恶劣情况下，血清中miRNA含量仍保持相对稳定。本研究正是基于microRNA的这个特征来研究miR-138与心力衰竭的关系。一些血清microRNA已被证明可以作为心血管疾病的分子标志物，如miR-1、miR-133a和miR-208a可作为急性心肌梗死患者的诊断标志物。现在大量的研究表明，miRNA与心脏疾病有着密切的相关性，2005年DRZhao首先发现miRNA-1-2特定性在心脏中存在并通过Hand2通道起作用，围绕miRNA的心脏作用的研究由此展开。迄今为止已发现miRNA在心肌肥大，心肌梗死后心律失常中起作用，并参与心肌的凋亡，其中miR-1、195、212、208、133等已经被证实通过不同的分子通路在上述的各个方面起作用。随着miRNA微阵列技术的发展，进一步证实多种miRNA参与了心脏病理性肥大及心力衰竭的发生。van Rooij等通过miRNAs微阵列技术检测发现在TAC（缩窄小鼠的主动脉弓诱导心肌肥大模型）小鼠及calcineurin蛋白转基因小鼠中，有21种miRNAs表达上调，7种miRNAs表达下调。
许多miRNA在心力衰竭心肌细胞凋亡、心室重构的信号转导过程中都有一定的调节作用，且心力衰竭患者中还可检测到一些miRNA水平的变化，miR-1、miR-29、miR-30、miR-133、miR-150、miR-7、miR-378等是下调的，而miR-23a、miR-125、miR-146、miR-195、miR-199、miR-214、miR-181b等是上调的，这些miRNA从分子机制上影响心力衰竭的发生、发展过程；在心衰早期，这四种miRNA的改变可引起信号通路紊乱。
本研究结果表明心力衰竭患者的血清miR-138表达水平较非心力衰竭者增高，不同NYHA分级心力衰竭组中血清miR-138水平较对照组高，且随NYHA心功能分级增加而升高，因miR-138是心肌肥大和心力衰竭的正性调节因子，当心力衰竭病情越严重时其心肌细胞中miR-138含量越高，释放进入外周血的量也随之增大，这可能是血清miR-138水平随NYHA分级增加而升高的原因之一。另外，miR-138与目前临床常用心功能评价指标具有较好的相关性，如与氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）水平呈正相关，与左室射血分数（LVEF）值呈负相关，提示miRNA-138可能参与了心力衰竭的病理生理过程，由衰竭的心肌细胞释放从而进入血液循环之中。其诊断心衰的ROC曲线下面积AUC为0.81，也说明对诊断有参考价值。综上所述血清microRNA-138水平可用作评价心力衰竭病情严重程度的一个客观生物标志物。