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【目的】开发高基元(4—6)碱基重复微卫星标记,分析种质资源遗传多样性,为糜子遗传和进化研究提供理论基础。【方法】用隶属函数、主成分分析和聚类分析综合评价糜子资源表型多样性,用前期糜子转录组测序获得高基元SSR引物对地理来源差异大的糜子材料进行PCR扩增检测其多态性,用Power Marker 3.25计算遗传多样性参数,用Pop Gen 1.32计算Nei’s遗传距离,用MEGA 5.0进行聚类分析,用Structure 2.2鉴定遗传类群。【结果】96份糜子资源株高和穗长变异最丰富,多样性指数分别为2.08和1.91。PCR扩增发现,占56.29%的85对引物具多态性,其中四、五和六碱基重复引物分别为71对(83.53%)、10对(11.76%)和4对(4.7%)。85个标记扩增产物大小分布为100—450 bp,PIC值平均为0.51,Rp值为1.00—5.75,平均为3.15。四、五和六碱基重复SSR的平均Rp值分别为3.15、2.8和4.0。基于Rp值分析SSR的分布频次,发现85个标记分布区间为0—1、1—2、2—3、3—4、4—5和5—6,分别包含1(1.18%)、15(17.65%)、31(36.47%)、20(23.53%)、12(14.12%)和6(7.06%)个标记,60%(51个)的标记分布在区间2—3和3—4。用85个SSR扩增96份糜子资源,共检测到232个等位变异,每个位点检测到等位变异2—3个,平均2.7294个;62个位点产生3个变异,23个位点产生2个变异;多样性指数为0.2842—1.0633,平均为0.7708;PIC值为0.0400—0.7281,平均为0.4723。不同生态区糜子种质间的遗传距离为0.0093—0.5052(平均为0.1798),遗传一致度为0.6034—0.9907(平均为0.8485)。基于UPGMA将96个糜子基因型聚为4个群组,第一群组主要属于北方春糜子区;第二群主要属于东北春糜子区;第三群组主要属于华北夏糜子区;第四群组主要属于黄土高原春夏糜子区。遗传结构分析将96份试材划分为4个类群,分别代表黄土高原、华北、东北和北方基因库。UPGMA聚类分析和遗传结构分析结果基本一致,均与地理起源相关。【结论】在糜子中构建了85个四、五和六碱基重复微卫星标记,这些高基元SSR的引物分辨率(Rp)高,对不同基因型分辨能力强,PCR扩增多态性好;用其评估中国糜子资源的遗传差异发现,黄土高原春夏糜子区和北方春糜子区资源遗传多样性最丰富。