背景:胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。目的:对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-09/11在上海市长征医院神经外科实验室完成。材料:中间载体pGEM-TEasy质粒购于Promega公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。方法:从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用反转录-聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。主要观察指标:总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。结果:抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S3条带。且总RNA的A260nm/A280nm值为1.903。聚合酶链反应结果显示,在约1300bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致。重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白。结论:用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。