论文部分内容阅读
目的构建靶向基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)的短发夹RNA(shRNA) 表达载体,并观察其对大鼠肾小球系膜细胞的凋亡和细胞外基质分泌的影响。方法构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的RNA干扰真核表达载体pEGFP-1／TIMP-1 shRNA,利用该载体介导两个TIMP-1 shRNA,分别为TIMP-1 shRNA1和TIMP-1 shRNA2。用荧光显微镜观察EGFP的表达。采用RT-PCR和Western印迹测定宿主细胞TIMP-1在基因和蛋白水平的沉默效果。用 ELISA检测细胞外基质成份的表达。以流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果(1)测序证实成功构建了针对TIMP-1的shRNA表达载体pEGFP-1／TIMP-1 shRNA;(2)荧光显微镜下,转染组细胞内均见绿色荧光;未转染组未见绿色荧光;(3)基因和蛋白水平的检测显示,与阴性对照组相比,TIMP-1 shRNA1组的TIMP-1明显受抑制(P<0．05),TIMP-1 shRNA2组抑制效果不明显;(4)ELISA结果显示,正常对照组FN、Ⅳ型胶原蛋白和LN的表达不随时间的延长而变化; 未转染组和阴性对照组在高糖诱导下,FN、Ⅳ型胶原蛋白和LN的表达随时间的延长而增加; 48、72 h的shRNA1组、抗体组和反义组对FN、Ⅳ型胶原蛋白、LN表达明显低于阴性对照组,以 shRNA1组最明显;(5)流式细胞仪结果显示,高糖诱导的各组细胞凋亡率随时间的延长而升高。在同一时间点shRNA1组细胞的凋亡率最高,反义组细胞的凋亡率次之,48 h和72 h的shRNA1 组细胞的凋亡率与其他各组比较,差异有统计学意义(P<0．05)。结论pEGFP-1介导的TIMP-1 shRNA1能更加有效的抑制大鼠肾小球系膜细胞中TIMP-1的表达,促进肾小球系膜细胞的凋亡并使细胞外基质的成份表达下降。