【摘 要】
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为进一步改造细胞色素P450 BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450 BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450 BM-3 (A74G/F87V/L188Q/E435T)为父本,在可能影响P450 BM-3催
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为进一步改造细胞色素P450 BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450 BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450 BM-3 (A74G/F87V/L188Q/E435T)为父本,在可能影响P450 BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催化产物颜色及组成进行筛选,得到了产物组成、酶动力学性质与父本不同的两个突变酶.突变酶D168W的吲哚羟基化产物中90%是靛玉红,而另一个突变酶D168R的产物中87%是靛蓝,产物组成均不同于亲本.在催化吲哚羟基化时,D168W的k_(cat)与父本相当,但K_m却是父本的4.8倍,催化活力只有父本的20%;而D168R的k_(cat)是父本的1.9倍,K_m是父本的82%,催化活力比父本提高了1.37倍.结果表明,在E435T突变上叠加D168位氨基酸残基突变对酶的催化性质产生了单一位点突变所不具有的协同效应,对酶催化的区域选择性和催化活力都有显著影响,以致改变了催化产物组成.这种基于知识的半理性定向进化方法由于是在关键位点进行突变,因此突变目的性强、突变效果显著.
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