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摘要[目的]研究水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A 的fkbM基因进行基因敲除，构建突变菌株ΔfkbMXoo，同时构建互补菌株ΔfkbMXoo （C）。通过运动性试验，确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99A相比，ΔfkbMXoo突变体运动性明显减弱，而互補菌株ΔfkbMXoo （C）能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。
关键词fkbMXoo；运动性；水稻白叶枯病菌
中图分类号S435.111.4+7文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）05-0144-03
Abstract[Objective] To study the effect of the fkbM gene of Xanthomonas oryzae pv. oryzae on motility.[Method] A deletion mutant of fkbM was generated by homologous recombination ΔfkbMXoo.To construct a complementary strain ΔfkbMXoo （C）.Using motiliy test experiment to confirm the effect of the fkbM gene on motility.[Result]Compared with wild type strain PXO99A，the mutant ΔfkbMXoo displayed reduced motility.In complementary strain ΔfkbMXoo（C），changed phenotypes were restored to certain degree.[Conclusion] The fkbM gene mutation of X.oryzae could reduce motility function of X.oryzae.
Key wordsfkbMXoo；Motility；Xanthomonas oryzae pv.oryzae
作者简介伍甜（1986—），男，湖南衡阳人，硕士，从事分子生物学及植物病理学研究。
收稿日期2016-12-23
水稻白叶枯病（Bacterial blight of rice）是我国水稻的三大病害之一，对水稻危害程度高，这种病害由黄单胞菌属水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo）侵染引起，属于细菌性病害。当水稻被白叶枯病菌感染后，通常会引起水稻减产20%～30%，在发病严重的水稻产地可能减产50%以上[1]。细菌通过鞭毛进行游动，鞭毛是细菌最主要的运动器官，细菌的游动性与致病性紧密相关[2] ，Xoo是单级生鞭毛，fkbM基因位于Xoo鞭毛糖基化岛基因簇上，其上游是糖基转移酶〖STBX〗rbfC基因，orfN、orf1和orf2是糖基转移酶基因，rbfC与orfN、orf1和orf2同源性很高[3] 。研究发现，位于糖基化岛中的糖基转移酶基因〖STBX〗orfN、orf1和orf2对细菌鞭毛运动性有影响[4]。但是fkbM基因对Xoo运动性的影响尚未有明确研究，该研究探索了fkbM基因对Xoo运动性的影响，为水稻白叶枯病菌致病机理研究提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒。
水稻白叶枯病菌PXO99A菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α 菌株及用于互补分析的广寄主范围载体 pHM1来源于中国农业科学院植物保护研究所；此次双交换突变体的载体 pK18mobsacB由中国科学院微生物研究所刘双江研究员提供；含庆大霉素（Gentamicin）抗性基因的载体 pBBR1MCS-5来自于中国农业科学院植物保护研究所；克隆载体 pMD18-T 购买于 TaKaRa（大连）公司。
1.1.2主要生化试剂与仪器。
试验所用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购买于 TaKaRa（大连）公司；抗生素均购买于Sigma公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购买于天根生物公司（北京）；其他试剂均为国产分析纯，购买于北京化工厂。试验过程中使用的抗生素及其浓度如下：壮观霉素（Sp）25 μg/mL、氨苄青霉素（Amp）100 μg/mL、庆大霉素（Gm）25 μg/mL。所用仪器主要有电转仪（Bio-Rad公司）；PCR 仪（Biometra 公司）；PerkinElmer lambda 35 型分光光度计（美国珀金埃尔默公司）。
1.2方法
1.2.1fkbM基因突变体自杀载体的构建。以PXO99A基因组为模板，运用Primer 5软件设计引物，LfkbMR：5′-CGGAATTCGTGGGTGCCAATGCTGTT-3′酶切位点EcoR I，LfkbMF：5′ -CGGGATCCGCCTACATGGGACTCGGGA-3′酶切位点BamH I；RfkbMR：5′-CCAAGCTTGAATGGGAAGCATGTGGC-3′酶切位点Xba I，RfkbMF：5′-GCTCTAGAGCCCAGGAATATTCACGATT-3′酶切位点Hind Ⅲ。
扩增fkbM基因的左臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。扩增fkbM基因的右臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃延伸补平10 min。通过琼脂糖凝胶回收，得到左、右臂基因片段，再通过T4连接酶，连接到pMD18-T载体上，热转化入E.coli 感受态细胞，通过培养提取，获得连接后质粒，即pMD左臂和pMD右臂，对扩增片段进行测序鉴定后，琼脂糖凝胶回收质粒。使用EcoR I和BamH I酶双酶切pMD右臂片段，琼脂糖凝胶回收右臂片段后，与EcoR I和BamH I酶双酶切的pMD左臂载体进行连接，转化至E.coli 感受态细胞，得到重组质粒 pMD左右臂。EcoR I和Hind Ⅲ酶切消化pMD左、右臂，通过Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ 双酶切得到左右臂片段，琼脂糖凝胶回收质粒后，与通过Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 双酶切 pK18mobsacB质粒载体连接，得到的质粒含有左右臂pK18mobsacBfkbM后，突变体自杀载体成功构建。 1.2.2fkbM基因突变体的构建。
（1）配制PSA 固体培养基，采用划线的方式活化野生型菌株PXO99A，置于28 ℃恒温培养箱，倒置培养2～3 d（防止霉菌污染）。
（2）在培养基中，挑取单个菌落，接种于 3 mL的M210 液体培养基中，200 r/min 、28 ℃恒温摇床中培养2 d，进一步活化菌株。
（3） 以1%的接种量转接到500 mL的M210 液体培养基中，200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长中期（OD600=1.0～1.2）。
（4）将含有菌液的培养基取出，置于冰上，冰浴 20 min，4 ℃、5 000 r/min离心10 min后取出倒出菌体。
（5）经过滤膜过滤的10%甘油，先置于冰上预冷，取出的菌体用预冷的等体积的甘油轻轻吹洗3次。
（6）将离心机设置4 ℃、5 000 r/min，对菌体进行离心，收集菌液，去除上清，在离心的最后1次，预留10%甘油轻轻吹洗，重悬菌体，此时该菌体的密度约为1.0×109个/mL。
（7）用TP管进行分装，每管约 30 μL，放入液氮速冻，将剩余的感受态细胞置于-80 ℃冰箱中备用。
（8）吸取20～50 ng 含有左右臂的pK18mobsacBfkbM 质粒加入到前期制作好的30 μL PXO99A 感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀质粒与感受态细胞，放入电击杯中（2 mm-gap），用手轻轻振动，使液体沉降至杯底，然后开始电击转化（V=2.0 kV，C=25 μF，R=200 Ω），吸取电击后的混合物加入到含有1 mL LB培养基的TP管中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h后，吸取该菌液，均匀涂布于含相应抗生素的 PSA或 LB 平板上，置于28 ℃恒温培养箱中，倒置继续培养3～7 d。
（9）提取含有突变体质粒pK18mobsacBfkbM ，将其电击转化，导入PXO99A 感受态细胞中，将电击后的混合溶液均匀涂布于含Gm 抗性的LB 平板上，通过抗性初步筛选转化子，放入28 ℃恒温培养箱中，倒置培养3～7 d，将能够在Gm 抗性平板上生长的单个菌落挑出，于含10%蔗糖的PSA 平板上划线培养，再次筛选转化子；最终还能长出的菌落，在同时含有Gm 抗性和10%蔗糖的PSA 平板上继续划线培养，还能继续长出菌落，该菌落即为突变菌株。自杀质粒pK18mobsacBfkbM 上含有高蔗糖致死基因sac B，通过筛选能在Gm 抗性和高浓度蔗糖平板上生长的菌落，得到fkbMXoo突变体基因，这是通过同源重组，Gm 等位置换了fkbM基因，最終所得突变菌株基因组中不含有自杀载体及高蔗糖致死基因sac B 的序列，最后通过PCR 扩增来验证突变菌株是否获取。
（10）从这些长出的菌落中，挑选5个单菌落，继续转接到不含Gm抗性的PSA平板上，放入恒温培养箱中，28 ℃培养，每隔2～3 d，从培养的菌中转接1次，连续继代培养20代。再次验证突变体，将培养20代后的突变体均匀涂布到含Gm抗性的PSA平板上，放入28 ℃恒温培养箱中培养，长出的菌落再次用PCR扩增的方法来检测突变体的稳定性。
1.2.3ΔfkbMXoo互补菌株的构建。以PXO99ADNA 为模板，用Primer 5软件设计引物，fkbMF：5′-CC〖ZZ（Z〗AAGCTT〖ZZ）〗GCATGGTGCACGGTCCC-3′酶切位点Hind Ⅲ，fkbMR：5′-GC〖ZZ（Z〗TCTAGA〖ZZ）〗TTACTCCGCCCAAGGCGG-3′酶切位点Xba I 。
以PCR 扩增包括自身启动子的fkbM序列，扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃下对扩增产物进行延伸补平10 min。将扩增出来的PCR产物，直接连接至pMD18-T载体上，然后送公司测序鉴定确认，将确认好的片段连接至pMD18-T载体，采用Hind Ⅲ和Xba I双酶切，通过凝胶电泳回收约1.2 kb 的目的片段，与经过同样Hind Ⅲ和Xba I双酶切的pBBR载体进行回收，将目的片段与pBBR载体进行连接，热击转化至E.coli 感受态细胞，然后用含有Amp抗性的LB固体平板进行筛选，挑取单个菌落，进行PCR扩增，得到含有目的片段的条带，说明构建的互补质粒成功，将该质粒命名为pBBRfkbM质粒。通过电击转化将质粒转入至ΔfkbMXoo感受态中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h。最后涂布于含Amp抗性的PSA 平板进行阳性转化子筛选，得到的菌株为ΔfkbMXoo的互补菌株ΔfkbMXoo （C）。
1.2.4鞭毛运动性测定。
通过划线培养，在PSA 平板活化待测菌株，挑取单个菌落，接种于M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温的摇床中培养至对数生长期，5 000 r/min离心收集菌体，用无菌水将待测菌液稀释到OD600=0.5，取1 μL 稀释后的待测菌液，点接于半固体PSA培养基平板中央位置，至于28 ℃恒温培养箱，培养4 d后，观察待测菌运动情况。
2结果与分析
2.1ΔfkbMXoo突变体菌株的构建验证
由于野生的PXO99A菌株基因组内是不含Gm抗性基因的，因此可以用Gm抗性来筛选突变体；由于突变体插入了Gm抗性基因，因此能够在含有Gm抗性的PSA固体培养基上生长。挑选5个单个突变克隆，在不含Gm抗性的PSA平板上划线，置于28 ℃恒温培养箱中培养，每隔3 d转接1次，连续继代培养3代，然后取第3代的培养液，在含Gm抗性的PSA平板上进行划线培养。挑取单菌落，使用引物LfkbMR/RfkbMF进行扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增（95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。通过PCR扩增的方法进行验证，由于Gm抗性基因比所置换的fkbM基因短约500 bp，所以用PXO99A野生型菌种作为模板的扩增条带要比用突变菌株ΔfkbMXoo菌株扩增条带小约500 bp（图 1）。PCR结果验证显示已获得稳定的ΔfkbMXoo菌株。 2.2ΔfkbMXoo互补菌株的构建验证
配制PSA 平板（含Gm和Sp双抗性），对阳性克隆进行筛选，将单个菌落在培养基上划线，放入28 ℃恒温培养箱培养，每3 d转接1次，经过3代的连续继代培养。从互补菌株中提取质粒作为模板，使用引物fkbMF/fkbMR，通过PCR扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增（95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。PCR扩增的目标片段长度约为1.2 kb，通过PCR扩增目的基因（图2），再进行琼脂糖凝胶电泳，可以得到大小一致的目的片段，说明重组克隆已进入ΔfkbMXoo 并稳定存在，互补菌株为ΔfkbMXoo （C）。
2.3ΔfkbMXoo鞭毛运动性测定
将 PXO99A、ΔfkbMXoo 和ΔfkbMXoo （C）分别接入M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水稀释菌体至OD600=0.5，取1 μL培养液点接于半固体培养基，28 ℃培养4 d，观察各个菌株的运动痕迹，量取各个培养皿中菌体游动的直径长度。培养4 d后，发现ΔfkbMXoo 的游动直径比PXO99A 减小约0.5 cm，丧失了部分游动能力，互补菌株可以基本恢复至野生型运动水平（图3），通过20个平板的重复验证，发现结果重复性良好，说明fkbM基因的突变使菌体的运动能力下降。
3结论与讨论
fkbM基因存在于Xoo基因中的鞭毛糖基化岛的基因簇中，其具体生物学功能尚不明确，由于其处于鞭毛糖基化岛基因簇当中，因此可能对鞭毛蛋白产生影响。该研究成功构建了水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化岛fkbM基因缺失的突变体，并构建了相应的互补菌株，发现fkbM基因缺失能够减弱Xoo的运动能力。
通过生物信息学分析，fkbM基因是一个甲基化转移酶，分子量预测39 ku。通过对水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白的提取，SDS-PAGE与Western Blot检测时发现，分子量大小为45 ku，说明蛋白存在着修饰。另外发现fkbM基因突变菌株鞭毛蛋白与rbfC基因突变体鞭蛋白均能够引起鞭毛蛋白分子量减小。rbfC基因是一个糖基转移酶，根据现有研究可知，丁香假單胞菌的鞭毛糖基化岛基因簇由3个基因〖STBX〗（orf1～orf3）组成，其中orf1和orf2是糖基转移酶基因[4-5]，在丁香假单胞菌缺失糖基转移酶基因后，由于鞭毛蛋白缺少糖基化修饰，鞭毛分子量也减小。可以推测fkbM基因或rbfC基因的缺失影响了白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化的修饰，进一步导致水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白分子量减小。fkbM基因的缺失，影响了鞭毛分子量的大小，同时已知蛋白糖基化能够影响蛋白的三维结构[6]，可以推测当fkbM基因缺失，鞭毛糖基化过程也受到了影响，从而影响了鞭毛蛋白的构象，进一步影响了鞭毛的游动。通过研究fkbM基因对Xoo运动性的影响发现，细菌运动性通常与致病性存在紧密联系。该研究对水稻白叶枯病菌致病机理提供了新的发现，能为研究水稻白叶枯病菌致病机理打下基础。
参考文献
[1] EZUKA A，KAKU H.A historical review of bacterial blight of rice[J].Bulletin of the national institute of parasitological resources，2000，15：207.
[2] JOSENHANS C，SUERBAUM S.The role of motility as a virulence factor in bacteria[J].International journal of medical microbiology，2002，291（8）：605-614.
[3] 孙艳伟，文景芝，吴茂森，等.糖基转移酶基因rbfCxoo缺失突变导致水稻白叶枯病菌毒性表达增强[J].微生物学报，2009，49（6）：740-745.
[4] TAKEUCHI K，TAGUCHI F，INAGAKI Y，et al.Flagellin glycosylation island in Pseudomonas syringae pv.glycinea and its role in host specificity[J].J Bacteriol，2003，185（22）：6658-6665.
[5] 〖ZK（#〗TAGUCHI F，OGAWA Y，TAKEUCHI K，et al.A homologue of the 3oxoacyl（acyl carrier protein） synthase Ⅲ gene located in the glycosylation island of Pseudomonas syringae pv.tabaci regulates virulence factors via Nacyl homoserine lactone and fatty acid synthesis[J].J Bacteriol，2006，188（24）：8376-8384.
[6] LECHNER J，WIELAND F.Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins[J].Annu Rev of Biochem，1989，58（1）：173-194.
关键词fkbMXoo；运动性；水稻白叶枯病菌
中图分类号S435.111.4+7文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）05-0144-03
Abstract[Objective] To study the effect of the fkbM gene of Xanthomonas oryzae pv. oryzae on motility.[Method] A deletion mutant of fkbM was generated by homologous recombination ΔfkbMXoo.To construct a complementary strain ΔfkbMXoo （C）.Using motiliy test experiment to confirm the effect of the fkbM gene on motility.[Result]Compared with wild type strain PXO99A，the mutant ΔfkbMXoo displayed reduced motility.In complementary strain ΔfkbMXoo（C），changed phenotypes were restored to certain degree.[Conclusion] The fkbM gene mutation of X.oryzae could reduce motility function of X.oryzae.
Key wordsfkbMXoo；Motility；Xanthomonas oryzae pv.oryzae
作者简介伍甜（1986—），男，湖南衡阳人，硕士，从事分子生物学及植物病理学研究。
收稿日期2016-12-23
水稻白叶枯病（Bacterial blight of rice）是我国水稻的三大病害之一，对水稻危害程度高，这种病害由黄单胞菌属水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，简称Xoo）侵染引起，属于细菌性病害。当水稻被白叶枯病菌感染后，通常会引起水稻减产20%～30%，在发病严重的水稻产地可能减产50%以上[1]。细菌通过鞭毛进行游动，鞭毛是细菌最主要的运动器官，细菌的游动性与致病性紧密相关[2] ，Xoo是单级生鞭毛，fkbM基因位于Xoo鞭毛糖基化岛基因簇上，其上游是糖基转移酶〖STBX〗rbfC基因，orfN、orf1和orf2是糖基转移酶基因，rbfC与orfN、orf1和orf2同源性很高[3] 。研究发现，位于糖基化岛中的糖基转移酶基因〖STBX〗orfN、orf1和orf2对细菌鞭毛运动性有影响[4]。但是fkbM基因对Xoo运动性的影响尚未有明确研究，该研究探索了fkbM基因对Xoo运动性的影响，为水稻白叶枯病菌致病机理研究提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒。
水稻白叶枯病菌PXO99A菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）DH 5α 菌株及用于互补分析的广寄主范围载体 pHM1来源于中国农业科学院植物保护研究所；此次双交换突变体的载体 pK18mobsacB由中国科学院微生物研究所刘双江研究员提供；含庆大霉素（Gentamicin）抗性基因的载体 pBBR1MCS-5来自于中国农业科学院植物保护研究所；克隆载体 pMD18-T 购买于 TaKaRa（大连）公司。
1.1.2主要生化试剂与仪器。
试验所用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购买于 TaKaRa（大连）公司；抗生素均购买于Sigma公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购买于天根生物公司（北京）；其他试剂均为国产分析纯，购买于北京化工厂。试验过程中使用的抗生素及其浓度如下：壮观霉素（Sp）25 μg/mL、氨苄青霉素（Amp）100 μg/mL、庆大霉素（Gm）25 μg/mL。所用仪器主要有电转仪（Bio-Rad公司）；PCR 仪（Biometra 公司）；PerkinElmer lambda 35 型分光光度计（美国珀金埃尔默公司）。
1.2方法
1.2.1fkbM基因突变体自杀载体的构建。以PXO99A基因组为模板，运用Primer 5软件设计引物，LfkbMR：5′-CGGAATTCGTGGGTGCCAATGCTGTT-3′酶切位点EcoR I，LfkbMF：5′ -CGGGATCCGCCTACATGGGACTCGGGA-3′酶切位点BamH I；RfkbMR：5′-CCAAGCTTGAATGGGAAGCATGTGGC-3′酶切位点Xba I，RfkbMF：5′-GCTCTAGAGCCCAGGAATATTCACGATT-3′酶切位点Hind Ⅲ。
扩增fkbM基因的左臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。扩增fkbM基因的右臂，PCR的扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃延伸补平10 min。通过琼脂糖凝胶回收，得到左、右臂基因片段，再通过T4连接酶，连接到pMD18-T载体上，热转化入E.coli 感受态细胞，通过培养提取，获得连接后质粒，即pMD左臂和pMD右臂，对扩增片段进行测序鉴定后，琼脂糖凝胶回收质粒。使用EcoR I和BamH I酶双酶切pMD右臂片段，琼脂糖凝胶回收右臂片段后，与EcoR I和BamH I酶双酶切的pMD左臂载体进行连接，转化至E.coli 感受态细胞，得到重组质粒 pMD左右臂。EcoR I和Hind Ⅲ酶切消化pMD左、右臂，通过Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ 双酶切得到左右臂片段，琼脂糖凝胶回收质粒后，与通过Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 双酶切 pK18mobsacB质粒载体连接，得到的质粒含有左右臂pK18mobsacBfkbM后，突变体自杀载体成功构建。 1.2.2fkbM基因突变体的构建。
（1）配制PSA 固体培养基，采用划线的方式活化野生型菌株PXO99A，置于28 ℃恒温培养箱，倒置培养2～3 d（防止霉菌污染）。
（2）在培养基中，挑取单个菌落，接种于 3 mL的M210 液体培养基中，200 r/min 、28 ℃恒温摇床中培养2 d，进一步活化菌株。
（3） 以1%的接种量转接到500 mL的M210 液体培养基中，200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长中期（OD600=1.0～1.2）。
（4）将含有菌液的培养基取出，置于冰上，冰浴 20 min，4 ℃、5 000 r/min离心10 min后取出倒出菌体。
（5）经过滤膜过滤的10%甘油，先置于冰上预冷，取出的菌体用预冷的等体积的甘油轻轻吹洗3次。
（6）将离心机设置4 ℃、5 000 r/min，对菌体进行离心，收集菌液，去除上清，在离心的最后1次，预留10%甘油轻轻吹洗，重悬菌体，此时该菌体的密度约为1.0×109个/mL。
（7）用TP管进行分装，每管约 30 μL，放入液氮速冻，将剩余的感受态细胞置于-80 ℃冰箱中备用。
（8）吸取20～50 ng 含有左右臂的pK18mobsacBfkbM 质粒加入到前期制作好的30 μL PXO99A 感受态细胞中，用移液枪轻轻吹打混匀质粒与感受态细胞，放入电击杯中（2 mm-gap），用手轻轻振动，使液体沉降至杯底，然后开始电击转化（V=2.0 kV，C=25 μF，R=200 Ω），吸取电击后的混合物加入到含有1 mL LB培养基的TP管中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h后，吸取该菌液，均匀涂布于含相应抗生素的 PSA或 LB 平板上，置于28 ℃恒温培养箱中，倒置继续培养3～7 d。
（9）提取含有突变体质粒pK18mobsacBfkbM ，将其电击转化，导入PXO99A 感受态细胞中，将电击后的混合溶液均匀涂布于含Gm 抗性的LB 平板上，通过抗性初步筛选转化子，放入28 ℃恒温培养箱中，倒置培养3～7 d，将能够在Gm 抗性平板上生长的单个菌落挑出，于含10%蔗糖的PSA 平板上划线培养，再次筛选转化子；最终还能长出的菌落，在同时含有Gm 抗性和10%蔗糖的PSA 平板上继续划线培养，还能继续长出菌落，该菌落即为突变菌株。自杀质粒pK18mobsacBfkbM 上含有高蔗糖致死基因sac B，通过筛选能在Gm 抗性和高浓度蔗糖平板上生长的菌落，得到fkbMXoo突变体基因，这是通过同源重组，Gm 等位置换了fkbM基因，最終所得突变菌株基因组中不含有自杀载体及高蔗糖致死基因sac B 的序列，最后通过PCR 扩增来验证突变菌株是否获取。
（10）从这些长出的菌落中，挑选5个单菌落，继续转接到不含Gm抗性的PSA平板上，放入恒温培养箱中，28 ℃培养，每隔2～3 d，从培养的菌中转接1次，连续继代培养20代。再次验证突变体，将培养20代后的突变体均匀涂布到含Gm抗性的PSA平板上，放入28 ℃恒温培养箱中培养，长出的菌落再次用PCR扩增的方法来检测突变体的稳定性。
1.2.3ΔfkbMXoo互补菌株的构建。以PXO99ADNA 为模板，用Primer 5软件设计引物，fkbMF：5′-CC〖ZZ（Z〗AAGCTT〖ZZ）〗GCATGGTGCACGGTCCC-3′酶切位点Hind Ⅲ，fkbMR：5′-GC〖ZZ（Z〗TCTAGA〖ZZ）〗TTACTCCGCCCAAGGCGG-3′酶切位点Xba I 。
以PCR 扩增包括自身启动子的fkbM序列，扩增程序为先通过95 ℃预变性3 min，再经过30 个循环扩增（95 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃下对扩增产物进行延伸补平10 min。将扩增出来的PCR产物，直接连接至pMD18-T载体上，然后送公司测序鉴定确认，将确认好的片段连接至pMD18-T载体，采用Hind Ⅲ和Xba I双酶切，通过凝胶电泳回收约1.2 kb 的目的片段，与经过同样Hind Ⅲ和Xba I双酶切的pBBR载体进行回收，将目的片段与pBBR载体进行连接，热击转化至E.coli 感受态细胞，然后用含有Amp抗性的LB固体平板进行筛选，挑取单个菌落，进行PCR扩增，得到含有目的片段的条带，说明构建的互补质粒成功，将该质粒命名为pBBRfkbM质粒。通过电击转化将质粒转入至ΔfkbMXoo感受态中，置于100 r/min 、28 ℃恒温摇床中，振荡培养 6 h。最后涂布于含Amp抗性的PSA 平板进行阳性转化子筛选，得到的菌株为ΔfkbMXoo的互补菌株ΔfkbMXoo （C）。
1.2.4鞭毛运动性测定。
通过划线培养，在PSA 平板活化待测菌株，挑取单个菌落，接种于M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温的摇床中培养至对数生长期，5 000 r/min离心收集菌体，用无菌水将待测菌液稀释到OD600=0.5，取1 μL 稀释后的待测菌液，点接于半固体PSA培养基平板中央位置，至于28 ℃恒温培养箱，培养4 d后，观察待测菌运动情况。
2结果与分析
2.1ΔfkbMXoo突变体菌株的构建验证
由于野生的PXO99A菌株基因组内是不含Gm抗性基因的，因此可以用Gm抗性来筛选突变体；由于突变体插入了Gm抗性基因，因此能够在含有Gm抗性的PSA固体培养基上生长。挑选5个单个突变克隆，在不含Gm抗性的PSA平板上划线，置于28 ℃恒温培养箱中培养，每隔3 d转接1次，连续继代培养3代，然后取第3代的培养液，在含Gm抗性的PSA平板上进行划线培养。挑取单菌落，使用引物LfkbMR/RfkbMF进行扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增（95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。通过PCR扩增的方法进行验证，由于Gm抗性基因比所置换的fkbM基因短约500 bp，所以用PXO99A野生型菌种作为模板的扩增条带要比用突变菌株ΔfkbMXoo菌株扩增条带小约500 bp（图 1）。PCR结果验证显示已获得稳定的ΔfkbMXoo菌株。 2.2ΔfkbMXoo互补菌株的构建验证
配制PSA 平板（含Gm和Sp双抗性），对阳性克隆进行筛选，将单个菌落在培养基上划线，放入28 ℃恒温培养箱培养，每3 d转接1次，经过3代的连续继代培养。从互补菌株中提取质粒作为模板，使用引物fkbMF/fkbMR，通过PCR扩增，PCR的扩增程序如下：先通过95 ℃预变性3 min，再经过30个循环扩增（95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃进行延伸补平10 min。PCR扩增的目标片段长度约为1.2 kb，通过PCR扩增目的基因（图2），再进行琼脂糖凝胶电泳，可以得到大小一致的目的片段，说明重组克隆已进入ΔfkbMXoo 并稳定存在，互补菌株为ΔfkbMXoo （C）。
2.3ΔfkbMXoo鞭毛运动性测定
将 PXO99A、ΔfkbMXoo 和ΔfkbMXoo （C）分别接入M210 液体培养基中，置于200 r/min、28 ℃恒温摇床中培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水稀释菌体至OD600=0.5，取1 μL培养液点接于半固体培养基，28 ℃培养4 d，观察各个菌株的运动痕迹，量取各个培养皿中菌体游动的直径长度。培养4 d后，发现ΔfkbMXoo 的游动直径比PXO99A 减小约0.5 cm，丧失了部分游动能力，互补菌株可以基本恢复至野生型运动水平（图3），通过20个平板的重复验证，发现结果重复性良好，说明fkbM基因的突变使菌体的运动能力下降。
3结论与讨论
fkbM基因存在于Xoo基因中的鞭毛糖基化岛的基因簇中，其具体生物学功能尚不明确，由于其处于鞭毛糖基化岛基因簇当中，因此可能对鞭毛蛋白产生影响。该研究成功构建了水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化岛fkbM基因缺失的突变体，并构建了相应的互补菌株，发现fkbM基因缺失能够减弱Xoo的运动能力。
通过生物信息学分析，fkbM基因是一个甲基化转移酶，分子量预测39 ku。通过对水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白的提取，SDS-PAGE与Western Blot检测时发现，分子量大小为45 ku，说明蛋白存在着修饰。另外发现fkbM基因突变菌株鞭毛蛋白与rbfC基因突变体鞭蛋白均能够引起鞭毛蛋白分子量减小。rbfC基因是一个糖基转移酶，根据现有研究可知，丁香假單胞菌的鞭毛糖基化岛基因簇由3个基因〖STBX〗（orf1～orf3）组成，其中orf1和orf2是糖基转移酶基因[4-5]，在丁香假单胞菌缺失糖基转移酶基因后，由于鞭毛蛋白缺少糖基化修饰，鞭毛分子量也减小。可以推测fkbM基因或rbfC基因的缺失影响了白叶枯病菌鞭毛蛋白糖基化的修饰，进一步导致水稻白叶枯病菌鞭毛蛋白分子量减小。fkbM基因的缺失，影响了鞭毛分子量的大小，同时已知蛋白糖基化能够影响蛋白的三维结构[6]，可以推测当fkbM基因缺失，鞭毛糖基化过程也受到了影响，从而影响了鞭毛蛋白的构象，进一步影响了鞭毛的游动。通过研究fkbM基因对Xoo运动性的影响发现，细菌运动性通常与致病性存在紧密联系。该研究对水稻白叶枯病菌致病机理提供了新的发现，能为研究水稻白叶枯病菌致病机理打下基础。
参考文献
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