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小曲清香型是云南生产的白酒香型代表，这是一种以粮谷为主要酿造原料，以小曲或纯种根霉为糖化发酵剂，采用传统的固态法生产，不添加任何呈香呈味呈色物质的白酒。好的小曲清香型白酒要经过糖化发酵、蒸煮培菌等极其复杂特殊的酿造工艺，唯有如此，酒体才会呈现甘醇的口感。而很多没钱、没技术、没好原料的小作坊、小企业，为了达到这种甘醇的口感，就在制造过程中非法添加一些添加剂，比如甜味剂、增香剂等来达到良好的香气和口感。我国在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》GB2760-2014中明确规定了甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜等甜味剂的适用范围及添加限量，而纯白酒中不得使用甜味剂。
对于食品中甜味剂的检测，国家标准涉及的大多是色谱法，比如高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法，存在检出限高、只能单一检测一种或两种甜味剂、多种甜味剂同时检测分离效果不佳等问题。而液相色谱串联质谱法具有定性结果可靠、灵敏度高、能同时快速测定多种物质的特点，成为甜味剂检测领域的研究热点。近年来也有许多关于液质联用法同时检测白酒中多种甜味剂的方法研究，《白酒中四种甜味剂的测定-超高效液相色谱串联质谱法》DB34/T2498-2015和《白酒中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜和三氯蔗糖四种甜味剂的测定方法 液相色谱-串联质谱法》DBS52/007-2014这两个地方标准都采用液质联用法来检测白酒中的甜味剂，但只包含了4种甜味剂，种类较少，而其他的方法又存在一定的弊端，如前处理较繁琐、流动相复杂、灵敏度偏低、检出限和定量限较高、耗时长等。因此，本研究的目的就是要建立一种快捷、准确、灵敏度好、精密度高、可同时检测云南小曲清香型白酒中多种甜味剂的液质联用方法。
一、材料与仪器
1.样品。成品酒，取自于云南西双版纳傣族自治州景洪市、勐海县、勐腊县市售小曲清香白酒。
2.试剂。甲醇（色谱纯），美国Fisher公司；甲酸（色谱级），Aladdin；实验室用水，屈臣氏超纯水。
3.标准品。安赛蜜（液体，100171，1mg/mL，纯度>99.0%），北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；糖精钠（液体，19001，1mg/ml，纯度>99.0%），中国计量科学研究院；甜蜜素（固体，G855226，纯度99.9%），Dr.Ehrenstorfer公司；三氯蔗糖（固体，2000μg/ml，S047521，纯度99.9%），天津阿尔塔科技有限公司；阿斯巴甜（固体，128464，纯度≥97.7%），Dr.Ehrenstorfer公司；阿力甜（液体，70480，纯度≥99.8%），TMstandard；爱德万甜（固体，ALT702308，纯度>99.0%），天津阿尔塔科技有限公司；纽甜（液体，2008087，1000μg/mL，坛墨质检国家标准物质中心；甜菊糖苷（液体，S057199，1000μg/mL），天津阿尔塔科技有限公司。甲酸水溶液（0.1%）：准确移取0.1mL甲酸置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。
4.仪器。Agilent高效液相色谱串联质谱仪，安捷伦科技有限公司，Agilent1290InfinityⅡ/6470LC/TQ；万分之一天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，SI-224；水浴锅HH-6，常州国华电器有限公司；有机滤膜，孔径0.22μm，天津津滕实验设备有限公司。
二、实验与方法
1.标准溶液制备。（1）标准储备液。称取阿斯巴甜（固态）、甜蜜素（固态）、糖精钠（固态）、爱德万甜（固态）标准品各0.010g，置于10mL容量瓶中并用纯水定容，制成1mg/mL的标准储备液。安赛蜜、三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷均为1mg/mL的标准液。（2）标准使用液。取上述1mg/mL标准储备液1mL，用水定容至100mL，配置成10000μg/L的标准使用液。再用纯水稀释成浓度分别为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L的混合标准曲线系列，过0.22μm滤膜，依据液相色谱-串联质谱法测定。
2.白酒样品预处理。用烧杯称取样品约10g（精确至0.01g），置60℃恒温水浴，直至乙醇除净。再移入50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，依据液相色谱-串联质谱法测定。
3.液相色谱-串联质谱条件。（1）液相色谱条件。色谱柱：oroshell120EC-C18（2.1mm*100mm，1.9μm）；进样量：5μL；流动相：A：甲酸水溶液（0.1%），B：甲醇；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；采用梯度洗脱：0.0-0.5min，A：95%，B：5%；0.5-3.0min，A：95%-10%，B：5%-90%；3.0-6.5min，A：10%，B：90%；6.5-7.5min，A：10%-95%，B：90%-5%；7.5-8.0min，A：95%，B：5%。（2）质谱条件。离子源：电喷雾电离ESI（-）ESI（+）；毛细管电压：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛细管反吹干燥氣温度：280℃；毛细管反吹干燥气流量：9L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；扫描模式：多反应监测模式MRM；驻留时间：40ms。
三、结果与分析
1.样品前处理的优化。白酒样品中含有的乙醇会对检验结果产生干扰，采用滤膜过滤、离心、加水稀释的方法并不能完全消除乙醇的影响，采用氮吹或是旋转蒸发的方法对仪器的要求相对较高，耗时也比较长。本研究选择把样品于60℃水浴加热来除去乙醇，可以有效减弱乙醇基质干扰，降低乙醇对色谱峰峰型的影响，提高检测方法的准确性与重现性。 2.质谱条件的选择。将一定质量浓度的标准品连续注入质谱，在ESI负離子/正离子MS1Scan模式下扫描各甜味剂的母离子。结果表明，爱德万甜在正离子模式下有较强的质谱信号，其他8种甜味剂在负离子模式下有较强的质谱信号。因干燥气流速、干燥气温度、鞘气温度、电压、驻留时间等因素均会影响灵敏度，所以在不同的条件下进行了多次试验，最终确定的质谱条件是：毛细管电压：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛细管反吹干燥气温度：280℃；毛细管反吹干燥气流量：9L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；扫描模式：多反应监测模式MRM；驻留时间：40ms。在上述质谱条件下，对目标产物离子进行了自动优化，检测得到9种甜味剂化合物选择离子流图，详见图1，9种甜味剂化合物响应值与灵敏度都表现良好，目标物的信号与离子丰度较强。最终MRM优化参数结果详见表2。
3.线性范围和检出限。按5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L配制混合标准曲线浓度，在优化后的色谱和串联质谱条件下进行测定。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，得到标准曲线回归方程，详见表3。从表3可见，9种甜味剂在各自测定范围内的线性相关系数R2≥0.998，检出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L，灵敏度较高。
4.精密度和稳定性试验。取浓度分别为50μg/L、100μg/L、400μg/L且放置10天的三个混合标准溶液，在优化后的色谱和串联质谱条件下各连续进样6次，考察仪器的精密度，结果见表4。从表4可见，不同浓度标准品保留时间和峰面积的RSD分别是0.00%-0.210%和0.047%-1.400%，说明仪器的精密度和稳定性良好。
5.回收率试验。分别称取不含有分析物的来自西双版纳州不同县市的三个白酒样品各1份，分别加入高、中、低3种浓度（200μg/L、100μg/L、50μg/L）的混合标准溶液，按上述样品前处理步骤进行试验，计算其回收率，结果见表5。由表5可见，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、爱德万甜、纽甜、甜菊糖苷的加标回收率在95.2%-118.4%之间，说明该检测方法有较好的准确度，可以满足日常检测要求。
6.样品分析。按优化后的试验分析方法，对西双版纳州三个县市30个市售小曲清香型白酒样品进行检测，9种甜味剂均无响应值，即均未检出，符合国家对白酒甜味剂的要求。
本文采用高效液相色谱-串联质谱仪，建立了云南小曲清香白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、爱德万甜、纽甜、甜菊糖苷九种人工甜味剂同时检测的分析方法。该方法在8min内完成九种甜味剂目标化合物的分离，且安赛蜜、阿力甜、爱德万甜在质量浓度为5.0μg/L-100μg/L，糖精钠、纽甜在质量浓度为5.0μg/ L-200μg/L，阿斯巴甜在质量浓度为5.0-400μg/L，甜蜜素、三氯蔗糖、甜菊糖苷在质量浓度为5.0μg/L-500μg/L时，有良好的线性关系，相关系数R2≥0.998，检出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L。结果表明，该方法检测准确，灵敏度高，大大提高了分析效率，降低了仪器检测限和方法定量限，可为云南小曲清香白酒人工甜味剂非法添加的检测提供技术支撑。
对于食品中甜味剂的检测，国家标准涉及的大多是色谱法，比如高效液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法，存在检出限高、只能单一检测一种或两种甜味剂、多种甜味剂同时检测分离效果不佳等问题。而液相色谱串联质谱法具有定性结果可靠、灵敏度高、能同时快速测定多种物质的特点，成为甜味剂检测领域的研究热点。近年来也有许多关于液质联用法同时检测白酒中多种甜味剂的方法研究，《白酒中四种甜味剂的测定-超高效液相色谱串联质谱法》DB34/T2498-2015和《白酒中甜蜜素、糖精钠、安赛蜜和三氯蔗糖四种甜味剂的测定方法 液相色谱-串联质谱法》DBS52/007-2014这两个地方标准都采用液质联用法来检测白酒中的甜味剂，但只包含了4种甜味剂，种类较少，而其他的方法又存在一定的弊端，如前处理较繁琐、流动相复杂、灵敏度偏低、检出限和定量限较高、耗时长等。因此，本研究的目的就是要建立一种快捷、准确、灵敏度好、精密度高、可同时检测云南小曲清香型白酒中多种甜味剂的液质联用方法。
一、材料与仪器
1.样品。成品酒，取自于云南西双版纳傣族自治州景洪市、勐海县、勐腊县市售小曲清香白酒。
2.试剂。甲醇（色谱纯），美国Fisher公司；甲酸（色谱级），Aladdin；实验室用水，屈臣氏超纯水。
3.标准品。安赛蜜（液体，100171，1mg/mL，纯度>99.0%），北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；糖精钠（液体，19001，1mg/ml，纯度>99.0%），中国计量科学研究院；甜蜜素（固体，G855226，纯度99.9%），Dr.Ehrenstorfer公司；三氯蔗糖（固体，2000μg/ml，S047521，纯度99.9%），天津阿尔塔科技有限公司；阿斯巴甜（固体，128464，纯度≥97.7%），Dr.Ehrenstorfer公司；阿力甜（液体，70480，纯度≥99.8%），TMstandard；爱德万甜（固体，ALT702308，纯度>99.0%），天津阿尔塔科技有限公司；纽甜（液体，2008087，1000μg/mL，坛墨质检国家标准物质中心；甜菊糖苷（液体，S057199，1000μg/mL），天津阿尔塔科技有限公司。甲酸水溶液（0.1%）：准确移取0.1mL甲酸置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。
4.仪器。Agilent高效液相色谱串联质谱仪，安捷伦科技有限公司，Agilent1290InfinityⅡ/6470LC/TQ；万分之一天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，SI-224；水浴锅HH-6，常州国华电器有限公司；有机滤膜，孔径0.22μm，天津津滕实验设备有限公司。
二、实验与方法
1.标准溶液制备。（1）标准储备液。称取阿斯巴甜（固态）、甜蜜素（固态）、糖精钠（固态）、爱德万甜（固态）标准品各0.010g，置于10mL容量瓶中并用纯水定容，制成1mg/mL的标准储备液。安赛蜜、三氯蔗糖、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷均为1mg/mL的标准液。（2）标准使用液。取上述1mg/mL标准储备液1mL，用水定容至100mL，配置成10000μg/L的标准使用液。再用纯水稀释成浓度分别为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L的混合标准曲线系列，过0.22μm滤膜，依据液相色谱-串联质谱法测定。
2.白酒样品预处理。用烧杯称取样品约10g（精确至0.01g），置60℃恒温水浴，直至乙醇除净。再移入50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀，过0.22μm滤膜，依据液相色谱-串联质谱法测定。
3.液相色谱-串联质谱条件。（1）液相色谱条件。色谱柱：oroshell120EC-C18（2.1mm*100mm，1.9μm）；进样量：5μL；流动相：A：甲酸水溶液（0.1%），B：甲醇；流速：0.3mL/min；柱温：35℃；采用梯度洗脱：0.0-0.5min，A：95%，B：5%；0.5-3.0min，A：95%-10%，B：5%-90%；3.0-6.5min，A：10%，B：90%；6.5-7.5min，A：10%-95%，B：90%-5%；7.5-8.0min，A：95%，B：5%。（2）质谱条件。离子源：电喷雾电离ESI（-）ESI（+）；毛细管电压：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛细管反吹干燥氣温度：280℃；毛细管反吹干燥气流量：9L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；扫描模式：多反应监测模式MRM；驻留时间：40ms。
三、结果与分析
1.样品前处理的优化。白酒样品中含有的乙醇会对检验结果产生干扰，采用滤膜过滤、离心、加水稀释的方法并不能完全消除乙醇的影响，采用氮吹或是旋转蒸发的方法对仪器的要求相对较高，耗时也比较长。本研究选择把样品于60℃水浴加热来除去乙醇，可以有效减弱乙醇基质干扰，降低乙醇对色谱峰峰型的影响，提高检测方法的准确性与重现性。 2.质谱条件的选择。将一定质量浓度的标准品连续注入质谱，在ESI负離子/正离子MS1Scan模式下扫描各甜味剂的母离子。结果表明，爱德万甜在正离子模式下有较强的质谱信号，其他8种甜味剂在负离子模式下有较强的质谱信号。因干燥气流速、干燥气温度、鞘气温度、电压、驻留时间等因素均会影响灵敏度，所以在不同的条件下进行了多次试验，最终确定的质谱条件是：毛细管电压：3500V[ESI（+）]，3500V[ESI（-）]；毛细管反吹干燥气温度：280℃；毛细管反吹干燥气流量：9L/min；雾化器压力：40psi；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V[ESI（+）]，500V[ESI（-）]；扫描模式：多反应监测模式MRM；驻留时间：40ms。在上述质谱条件下，对目标产物离子进行了自动优化，检测得到9种甜味剂化合物选择离子流图，详见图1，9种甜味剂化合物响应值与灵敏度都表现良好，目标物的信号与离子丰度较强。最终MRM优化参数结果详见表2。
3.线性范围和检出限。按5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L配制混合标准曲线浓度，在优化后的色谱和串联质谱条件下进行测定。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，得到标准曲线回归方程，详见表3。从表3可见，9种甜味剂在各自测定范围内的线性相关系数R2≥0.998，检出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L，灵敏度较高。
4.精密度和稳定性试验。取浓度分别为50μg/L、100μg/L、400μg/L且放置10天的三个混合标准溶液，在优化后的色谱和串联质谱条件下各连续进样6次，考察仪器的精密度，结果见表4。从表4可见，不同浓度标准品保留时间和峰面积的RSD分别是0.00%-0.210%和0.047%-1.400%，说明仪器的精密度和稳定性良好。
5.回收率试验。分别称取不含有分析物的来自西双版纳州不同县市的三个白酒样品各1份，分别加入高、中、低3种浓度（200μg/L、100μg/L、50μg/L）的混合标准溶液，按上述样品前处理步骤进行试验，计算其回收率，结果见表5。由表5可见，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、爱德万甜、纽甜、甜菊糖苷的加标回收率在95.2%-118.4%之间，说明该检测方法有较好的准确度，可以满足日常检测要求。
6.样品分析。按优化后的试验分析方法，对西双版纳州三个县市30个市售小曲清香型白酒样品进行检测，9种甜味剂均无响应值，即均未检出，符合国家对白酒甜味剂的要求。
本文采用高效液相色谱-串联质谱仪，建立了云南小曲清香白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、爱德万甜、纽甜、甜菊糖苷九种人工甜味剂同时检测的分析方法。该方法在8min内完成九种甜味剂目标化合物的分离，且安赛蜜、阿力甜、爱德万甜在质量浓度为5.0μg/L-100μg/L，糖精钠、纽甜在质量浓度为5.0μg/ L-200μg/L，阿斯巴甜在质量浓度为5.0-400μg/L，甜蜜素、三氯蔗糖、甜菊糖苷在质量浓度为5.0μg/L-500μg/L时，有良好的线性关系，相关系数R2≥0.998，检出限LOD（S/N=3）是0.03μg/L-5.00μg/L，定量限LOQ（S/N=10）是0.1μg/L-15.0μg/L。结果表明，该方法检测准确，灵敏度高，大大提高了分析效率，降低了仪器检测限和方法定量限，可为云南小曲清香白酒人工甜味剂非法添加的检测提供技术支撑。