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【摘 要】 目的 探讨高压氧治疗在急性重症胰腺炎中的有效性。观察HBO在治疗大鼠急性胰腺炎的过程中，对肠屏障的保护作用，探讨其可能机制，并为合理开展相关临床治疗提供理论依据。方法 首先选取SD雄性大鼠，采用逆行胆胰管注射牛黄胆酸钠的方法制备胰腺炎模型。SAP-HBO组于造模成功后1h内给予高压氧治疗（压力为2ATA，氧浓度98%，治疗时间为1h），在术后3h、6h、12h和24h处死。检测正常对照组和各模型组大鼠血淀粉酶。计算SAP组及SAP-HAO组大鼠腹水量；用ELISA法检测血液中IL-2、IL-6、TNF-α水平及血DAO活性。结果 1、SAP-HBO组腹水量明显低于SAP组；2、SAP-HBO组IL-2、IL-6及TNF-α水平明显低于SAP组；3、SAP-HBO组血DAO浓度明显低于SAP组。结论 SAP时，高压氧治疗可能通过控制炎症因子，保护大鼠肠黏膜屏障功能，以此改善急性重症胰腺炎。
引言
急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是胰酶在一线内被激活后引起胰腺自身消化所产生的局部炎性反应，患者病死率约为5%～10%[1]。临床可分为轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎，前者多呈自限性，而后者起病急，进展快，病情重，死亡率高达30%[2-3]。
作为外科常见急腹症，除其本身的病变外，还极易并发全身炎症反应综合症（SIRS）和多器官功能衰竭（MODS）等并发症。目前也有许多的研究表明SAP时肠腔内随着缺血使营养缺失，黏膜细胞出现凋亡使肠屏障通透性改变，大量细菌及内毒素进入血液循环，从而诱发MODS[4-5]。
医学的不断进步，在研究SAP的道路上除了机制和治疗方案，越来越多的人开始注重SAP的辅助治疗。本实验通过建立大鼠SAP模型，观察HBO对于SAP的治疗效果，探讨其可能的机制，为合理开展相关临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物：成年健康雄性SD大鼠65只，250-280g，由河北联合大学动物实验中心提供。建模的实验大鼠术前禁食12h，自由饮水。ELISA试剂盒由上海信帆生物科技有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组：将65只大鼠随机分为4组，即正常对照组（5只）、假手术（sham）组（20只）、急性重症胰腺炎（SAP）组（20只），高压氧治疗组（SAP-HAO）组（20只）。其中sham组只进行单纯的开关腹术，SAP组及SAP-HAO组均采用逆行胆胰管注射牛黄胆酸钠的方法制备胰腺炎模型。sham组、SAP组及SAP-HAO组分为4个亚组，每组5只。sham组和SAP组在术后3h、6h、12h和24h处死。SAP-HBO组于造模成功后1h内给予高压氧治疗（压力为2ATA，氧浓度98%，治疗时间为1h），在术后3h、6h、12h和24h处死。
1.2.2 动物模型的制备：选成年SD大鼠，术前12h禁食，自由饮水，采用10%水合氯醛0.22g/100g行腹腔内注射麻醉，麻醉生效后于手术台固定。常规消毒、铺巾，经上腹正中切口入腹。进腹后，辨认胆胰管汇入十二指肠的位置，经十二指肠逆行穿刺胆胰管，并缓慢注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g），注射持续1min，停留5min。注射结束后放松动脉夹，然后拔出针头。观察到大鼠胰腺组织明显水肿、充血，缝合穿刺点肠壁，分层缝合腹壁后，将大鼠重新单独放入笼中，置于温度、湿度恒定且适宜的环境中，此时造模成功，大鼠继续禁食，但可自由饮水。
1.2.3 高压氧干预：SAP-HBO组大鼠于造模完成后60min内，置于密闭的动物高压氧舱内，以100%纯氧洗舱5min，以清除舱内原有空气。匀速升压至2ATA（1ATA=101.325kPa），当氧舱内氧浓度大95%以上时，以4L/min的速度持续给氧，并维持压力在2ATA，1h后以同样的速度减压至正常，出舱。
1.2.4 血清提取：SAP组大鼠造模成功后分别于术后第3、6、12、24h再次麻醉，使用采血针一端穿刺下腔静脉，另一端接入含促凝剂的生化采血管内，采血约2.5mL，室温下待凝血后，以3000r/min离心15min，分离得到的上清液即为血清，移液枪吸入1.5ml至EP管中。正常对照组及sham组同法取样，使用全自动生化仪检测血清胰淀粉酶（AMY）的变化。
1.2.5 腹水收集及测量：SAP组及SAP-HAO组大鼠于术后3、6、12、24h再次麻醉，经原腹部切口入腹，使用注射器尽可能吸尽大鼠腹腔及盆腔液体，收集于量筒中观察腹水性状并测量腹水量。
1.2.6 ELISA法测定血液中DAO、IL-2、IL-6、TNF-α的水平：于术后第3、6、12、24h再次麻醉，经下腔静脉采血，以3000r/min离心15min，分离得到的上清液即为血清，移液枪吸入1.5ml至EP管中。严格按照购买试剂盒的说明书步骤定量测量两组大鼠血清中的DAO及细胞因子水平。
1.2.7 统计学分析：所得数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS19.0统计软件进行处理，ELISA结果使用单因素方差分析进行两两比较，以P<0.05为具有统计学意义。
1.3 结果
1.3.1 各组大鼠血清淀粉酶的变化
血清酶学结果显示，与正常对照组相比，模型组3、6、12、24h各亚组血清淀粉酶（AMY）升高，且与正常对照组差异具有统计学意义（P<0.05）.（如图1）
1.3.2 SAP组和SAP-HBO组腹水量的变化
经过HBO治疗后，SAP-HBO组大鼠腹水量较SAP组大鼠腹水量明显减少，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（如图2）
Fig. 2 The changes of abdominal water quantity in SAP-HBO and SAP groups 1.3.3 DAO在SAP组和SAP-HBO组的表达水平变化
经高压氧治疗后，SAP-HAO组3、6、12、24h各亚组二胺氧化酶水平均低于SAP组，差异具有统计学意义（P<0.05）（如表2）。
1.3.4 IL-2在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-2表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表3）。
1.3.5 IL-6在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-6表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表4）
1.3.6 TNF-α在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-6表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表5）。
1.4 讨论
肠道细菌易位是SAP感染的主要原因，而肠屏障的破坏是细菌易位的前提。正常情况下，肠道具有屏障作用，可有效地阻挡肠道内500多种、浓度高达1012个/g的肠道内寄生菌及其毒素向肠腔外组织、器官移位，防止机体受内源性微生物及其毒素的侵害。而肠屏障功能主要依赖肠黏膜的完整性，SAP时肠腔内随着缺血使营养缺失，黏膜细胞出现凋亡使肠屏障通透性改变，大量细菌及内毒素进入血液循环，从而诱发MODS[4-5]。
1988年“Rinderkernchet”提出了SAP的“白细胞过度激活学说”[6]。认为吞噬细胞过度刺激中性粒细胞导致细胞因子和炎性介质的释放，造成不同程度的全身炎症反应，进而导致多器官功能衰竭。急性胰腺炎时，体内单核巨噬细胞、中性粒细胞、胰腺本身腺泡细胞等细胞过度活化释放出大量细胞因子及炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6并相互作用，形成网络，且不断循环促进，形成瀑布样反应，导致全身炎症反应综合症（SIRS）和多器官功能障碍综合症（MODS）。
二胺氧化酶（DAO）是人类和哺乳动物小肠粘膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用，其活性与粘膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
HBO能明显抑制厌氧菌的生长和毒素分泌，在应用有效抗菌药物的前提下，HBO也可用于一些需氧菌感染的治疗。其机理在于HBO增强病灶区内吞噬细胞对病原微生物的吞噬能力；抑制病原微生物的生长；与抗菌药物有协同作用。高压氧治疗可使组织血氧含量增加，改善和增强组织的供氧状态，促进毛细血管的增生，恢复血管弹性增强白细胞的杀伤能力。高压氧还可抑制厌氧菌的生长、繁殖，促进有毒物质的快速分离，清除体内气泡，促进水肿消退吸收，有利于神经末梢的修复与再生，改善其代谢，减少局部酸性代谢产物及生物胺类物质的存留，减轻局部血管痉挛，促进局部血液循环的恢复。
本实验研究结果显示，经过高压氧治疗后，大鼠体内三种炎症介质的水平明显下降，提示高压氧可能通过抑制炎症介质的释放达到减轻胰腺炎组织损伤。但对抗炎和促炎介质平衡的影响仍需要进一步的实验研究证实。高压氧治疗可以抑制二胺氧化酶（DAO）的表达，从而达到保护肠黏膜屏障的目的。但是HBO的临床效果还有待进一步研究，且它仅仅只能作为一种辅助性的治疗手段，尚不能完全替代抗菌素、抑酸剂及抑酶剂等常规急性胰腺炎治疗方法。同时，有文献指出组织、器官微血管的收缩会随着高压氧舱压力的升高逐渐加剧，而长期吸入高浓度的氧也会加剧毛细血管内皮损伤，引起血管外渗出[7]，因此，如何制定合理的治疗方案，包括如何选择HBO的治疗压力、治疗时间、氧气浓度等仍是下一步研究的方向。
参考文献
[1]Jung KH，Song SU，Yi t，et al.Human bone marrow-de-rived clonal mesenchymal stem cells inhibit inflammation and reduce acute pancreatitisrats[J]. Gastroente-rology，2011，140（3）：998-1008
[2]Warshaw AL . Improving the treatment of necrotizing pancreatitis A step up[J]. N Engl J Med，2 0 1 0，3 6 2 （ 1 6 ） ： 1 5 3 5- 1 5 3 7
[3]文礼，赵龙，金涛，等.重症急性胰腺炎继发感染的临床特点[J].中国中西医结合外科杂志，2010，16（2）：148.
[4]王思珍，李维勤.重症急性胰腺炎肠源性细菌易位的研究进展[J].中国使用外科杂志，2013，33（6）：515-518.
[5]李则春.急性胰腺炎的临床特点及治疗进展[J].当代医学，2013，19（25）：8-9.
[6]Sumac D，Fisic E e1 at Prognostic values of IL-6，IL-8，and IL-10 in acute pancrceatitis [J].J Clin Gastroenterol， 2006，40（3）： 209
[7]李矗，周树生，金魁等.急性胰腺炎模型大鼠高压氧治疗效果的实验研究[C].中华医学会第十九次全国高压氧医学学术会议论文集.2010：62-66.
引言
急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是胰酶在一线内被激活后引起胰腺自身消化所产生的局部炎性反应，患者病死率约为5%～10%[1]。临床可分为轻症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎，前者多呈自限性，而后者起病急，进展快，病情重，死亡率高达30%[2-3]。
作为外科常见急腹症，除其本身的病变外，还极易并发全身炎症反应综合症（SIRS）和多器官功能衰竭（MODS）等并发症。目前也有许多的研究表明SAP时肠腔内随着缺血使营养缺失，黏膜细胞出现凋亡使肠屏障通透性改变，大量细菌及内毒素进入血液循环，从而诱发MODS[4-5]。
医学的不断进步，在研究SAP的道路上除了机制和治疗方案，越来越多的人开始注重SAP的辅助治疗。本实验通过建立大鼠SAP模型，观察HBO对于SAP的治疗效果，探讨其可能的机制，为合理开展相关临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物：成年健康雄性SD大鼠65只，250-280g，由河北联合大学动物实验中心提供。建模的实验大鼠术前禁食12h，自由饮水。ELISA试剂盒由上海信帆生物科技有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组：将65只大鼠随机分为4组，即正常对照组（5只）、假手术（sham）组（20只）、急性重症胰腺炎（SAP）组（20只），高压氧治疗组（SAP-HAO）组（20只）。其中sham组只进行单纯的开关腹术，SAP组及SAP-HAO组均采用逆行胆胰管注射牛黄胆酸钠的方法制备胰腺炎模型。sham组、SAP组及SAP-HAO组分为4个亚组，每组5只。sham组和SAP组在术后3h、6h、12h和24h处死。SAP-HBO组于造模成功后1h内给予高压氧治疗（压力为2ATA，氧浓度98%，治疗时间为1h），在术后3h、6h、12h和24h处死。
1.2.2 动物模型的制备：选成年SD大鼠，术前12h禁食，自由饮水，采用10%水合氯醛0.22g/100g行腹腔内注射麻醉，麻醉生效后于手术台固定。常规消毒、铺巾，经上腹正中切口入腹。进腹后，辨认胆胰管汇入十二指肠的位置，经十二指肠逆行穿刺胆胰管，并缓慢注射5%牛黄胆酸钠（0.1ml/100g），注射持续1min，停留5min。注射结束后放松动脉夹，然后拔出针头。观察到大鼠胰腺组织明显水肿、充血，缝合穿刺点肠壁，分层缝合腹壁后，将大鼠重新单独放入笼中，置于温度、湿度恒定且适宜的环境中，此时造模成功，大鼠继续禁食，但可自由饮水。
1.2.3 高压氧干预：SAP-HBO组大鼠于造模完成后60min内，置于密闭的动物高压氧舱内，以100%纯氧洗舱5min，以清除舱内原有空气。匀速升压至2ATA（1ATA=101.325kPa），当氧舱内氧浓度大95%以上时，以4L/min的速度持续给氧，并维持压力在2ATA，1h后以同样的速度减压至正常，出舱。
1.2.4 血清提取：SAP组大鼠造模成功后分别于术后第3、6、12、24h再次麻醉，使用采血针一端穿刺下腔静脉，另一端接入含促凝剂的生化采血管内，采血约2.5mL，室温下待凝血后，以3000r/min离心15min，分离得到的上清液即为血清，移液枪吸入1.5ml至EP管中。正常对照组及sham组同法取样，使用全自动生化仪检测血清胰淀粉酶（AMY）的变化。
1.2.5 腹水收集及测量：SAP组及SAP-HAO组大鼠于术后3、6、12、24h再次麻醉，经原腹部切口入腹，使用注射器尽可能吸尽大鼠腹腔及盆腔液体，收集于量筒中观察腹水性状并测量腹水量。
1.2.6 ELISA法测定血液中DAO、IL-2、IL-6、TNF-α的水平：于术后第3、6、12、24h再次麻醉，经下腔静脉采血，以3000r/min离心15min，分离得到的上清液即为血清，移液枪吸入1.5ml至EP管中。严格按照购买试剂盒的说明书步骤定量测量两组大鼠血清中的DAO及细胞因子水平。
1.2.7 统计学分析：所得数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS19.0统计软件进行处理，ELISA结果使用单因素方差分析进行两两比较，以P<0.05为具有统计学意义。
1.3 结果
1.3.1 各组大鼠血清淀粉酶的变化
血清酶学结果显示，与正常对照组相比，模型组3、6、12、24h各亚组血清淀粉酶（AMY）升高，且与正常对照组差异具有统计学意义（P<0.05）.（如图1）
1.3.2 SAP组和SAP-HBO组腹水量的变化
经过HBO治疗后，SAP-HBO组大鼠腹水量较SAP组大鼠腹水量明显减少，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（如图2）
Fig. 2 The changes of abdominal water quantity in SAP-HBO and SAP groups 1.3.3 DAO在SAP组和SAP-HBO组的表达水平变化
经高压氧治疗后，SAP-HAO组3、6、12、24h各亚组二胺氧化酶水平均低于SAP组，差异具有统计学意义（P<0.05）（如表2）。
1.3.4 IL-2在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-2表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表3）。
1.3.5 IL-6在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-6表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表4）
1.3.6 TNF-α在SAP组和SAP-HBO组的表达水平
给予高压氧治疗后，与SAP组相比，SAP-HBO组中大鼠IL-6表达水平降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）（如表5）。
1.4 讨论
肠道细菌易位是SAP感染的主要原因，而肠屏障的破坏是细菌易位的前提。正常情况下，肠道具有屏障作用，可有效地阻挡肠道内500多种、浓度高达1012个/g的肠道内寄生菌及其毒素向肠腔外组织、器官移位，防止机体受内源性微生物及其毒素的侵害。而肠屏障功能主要依赖肠黏膜的完整性，SAP时肠腔内随着缺血使营养缺失，黏膜细胞出现凋亡使肠屏障通透性改变，大量细菌及内毒素进入血液循环，从而诱发MODS[4-5]。
1988年“Rinderkernchet”提出了SAP的“白细胞过度激活学说”[6]。认为吞噬细胞过度刺激中性粒细胞导致细胞因子和炎性介质的释放，造成不同程度的全身炎症反应，进而导致多器官功能衰竭。急性胰腺炎时，体内单核巨噬细胞、中性粒细胞、胰腺本身腺泡细胞等细胞过度活化释放出大量细胞因子及炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6并相互作用，形成网络，且不断循环促进，形成瀑布样反应，导致全身炎症反应综合症（SIRS）和多器官功能障碍综合症（MODS）。
二胺氧化酶（DAO）是人类和哺乳动物小肠粘膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用，其活性与粘膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。
HBO能明显抑制厌氧菌的生长和毒素分泌，在应用有效抗菌药物的前提下，HBO也可用于一些需氧菌感染的治疗。其机理在于HBO增强病灶区内吞噬细胞对病原微生物的吞噬能力；抑制病原微生物的生长；与抗菌药物有协同作用。高压氧治疗可使组织血氧含量增加，改善和增强组织的供氧状态，促进毛细血管的增生，恢复血管弹性增强白细胞的杀伤能力。高压氧还可抑制厌氧菌的生长、繁殖，促进有毒物质的快速分离，清除体内气泡，促进水肿消退吸收，有利于神经末梢的修复与再生，改善其代谢，减少局部酸性代谢产物及生物胺类物质的存留，减轻局部血管痉挛，促进局部血液循环的恢复。
本实验研究结果显示，经过高压氧治疗后，大鼠体内三种炎症介质的水平明显下降，提示高压氧可能通过抑制炎症介质的释放达到减轻胰腺炎组织损伤。但对抗炎和促炎介质平衡的影响仍需要进一步的实验研究证实。高压氧治疗可以抑制二胺氧化酶（DAO）的表达，从而达到保护肠黏膜屏障的目的。但是HBO的临床效果还有待进一步研究，且它仅仅只能作为一种辅助性的治疗手段，尚不能完全替代抗菌素、抑酸剂及抑酶剂等常规急性胰腺炎治疗方法。同时，有文献指出组织、器官微血管的收缩会随着高压氧舱压力的升高逐渐加剧，而长期吸入高浓度的氧也会加剧毛细血管内皮损伤，引起血管外渗出[7]，因此，如何制定合理的治疗方案，包括如何选择HBO的治疗压力、治疗时间、氧气浓度等仍是下一步研究的方向。
参考文献
[1]Jung KH，Song SU，Yi t，et al.Human bone marrow-de-rived clonal mesenchymal stem cells inhibit inflammation and reduce acute pancreatitisrats[J]. Gastroente-rology，2011，140（3）：998-1008
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[3]文礼，赵龙，金涛，等.重症急性胰腺炎继发感染的临床特点[J].中国中西医结合外科杂志，2010，16（2）：148.
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[5]李则春.急性胰腺炎的临床特点及治疗进展[J].当代医学，2013，19（25）：8-9.
[6]Sumac D，Fisic E e1 at Prognostic values of IL-6，IL-8，and IL-10 in acute pancrceatitis [J].J Clin Gastroenterol， 2006，40（3）： 209
[7]李矗，周树生，金魁等.急性胰腺炎模型大鼠高压氧治疗效果的实验研究[C].中华医学会第十九次全国高压氧医学学术会议论文集.2010：62-66.