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摘要：
目的 观察蓝莓对大鼠肝纤维化肝组织TGF-B1和MMP-2、TIMP-1mRNA表达的影响，探讨蓝莓对大鼠肝纤维化的预防保护作用机制。
方法 SD大鼠随机分为生理盐水对照组（A），模型组（B），蓝莓汁预防组（C），丹芍化纤胶囊预防组（D），蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组（E），用四氯化碳（CC14）复合因素复制大鼠肝纤维化模型，共8周。测定各组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性；并进行肝组织病理学检查；采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测TGF β1和MMP-2、TIMP-2mRNA的表达
结果 与B组比较，各预防组血清ALT及AST均明显降低（P<0.05）。与A组比较，B组TGF B 1、TIMP1的表达增加（P<0.05），MMP2的表达减少（P<0.05）。与B组比较，各预防组的TGF β1、TIMP1的表达均减少（P<0.05），而MMP2的表达增加（P<0.05）。
结论 蓝莓对CC14所致大鼠肝纤维化具有一定的预防保护作用，其机制可能与蓝莓抑制TGF-β1及TIMP-1分子的表达，增加MMP-2的表达有关。
关键词：蓝莓；肝纤维化；TGF-β1；MMP-2：TIMP-1
肝纤维化（hepatic fibrosis）是机体对慢性肝损伤的一种修复反应，是慢性肝病的共有病理变化。肝纤维化的实质是细胞外基质（extracellularMatrix，ECM）合成与降解失衡，导致ECM在肝内过度沉积所致。在肝内ECM降解中起关键作用的是基质金属蛋白酶（Matrix Mettalloproteinases，MMPs）和天然抑制物金属蛋白组织抑制剂（Tissue inhibitor of Mettalloproteinases，TIMPs）。TIMPs可特异性结合活化型的MMPs，导致后者功能失活。通过动物实验和临床研究，目前已认识到MMPs和TIMPs在肝纤维化中发挥着重要作用。
蓝莓属杜鹃花科越桔属，因其富含花青素、多酚类和黄酮类等生物活性物质，具有较强的抗氧化作用。本课题组的前期研究结果显示，蓝莓对四氯化碳（CC14）所致的大鼠急性肝损伤和大鼠肝纤维化有一定的预防作用。本研究旨在观察蓝莓对大鼠肝纤维化组织中TGF β1和MMP2、TIMP1表达的影响，进一步探讨蓝莓预防肝纤维化作用机制。
1.材料
1.1实验动物 雄性SD大鼠清洁级，体重220±20g，由贵阳医学院动物实验室提供。批号：SCXK（黔）2002-0001。
1.2主要药品与试剂 蓝莓（兔眼品种），由贵州省麻江县蓝莓生产基地提供，7月份采摘，-20℃保存，临用时解冻榨汁，2g干果约榨1ml蓝莓汁。丹芍化纤胶囊，胶囊由贵阳制药厂生产（批号：20081011）。TGF-β1、TIMP1、MMP2引物用Primer Express Soft Ware设计，委托上海捷瑞生物有限公司合成。β-actin引物由美国国家环境卫生科学研究所刘杰博士惠赠。CC14由成都金山化学试剂有限公司生产（批号：070410），胆固醇由北京化学试剂公司生产（批号：060801），SYBRGreen试剂盒由美国Applied Biosystems公司生产（批号：10804104），RNA纯化试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产（批号：#H6820），反转录试剂盒由加拿大Fermentas MBI公司生产（批号：00033699），Trizol由美国Invitrogen公司生产（批号：382739），DEPC、磷酸盐缓冲液（PBs液）、枸橼酸盐缓冲液均由武汉博士德生物工程有限公司（批号：AR0044、AR0030、AK0024）。
2.方法
2.1分组 45只雄性SD大鼠随机分为5组：生理盐水对照组（A组）、模型组（B组）、蓝莓汁预防组（C组）、丹芍化纤胶囊预防组（D组）、蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组（E组），每组各9只。
2.2模型复制除正常对照组外，其他4组用复合病因刺激制备肝纤维化模型。模型制备首剂为0.4 ml/100g CC14皮下注射，CC14浓度为40%，按2：3比例与花生油配制，每隔4 d注射1次，以后剂量为0.3 ml/100g，同时给予高脂饮食（79.5%玉米粉、20%猪油、0.5%胆固醇），共8周。同期，蓝莓汁预防组用蓝莓汁（1.5 ml//100g）每天灌胃1次。丹芍化纤胶囊预防组用丹芍化纤胶囊（0.1 g/100g）每天灌胃1次。蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组用蓝莓汁（1.5ml//100g） 丹芍化纤胶囊（0.1g/100g）每天灌胃1次。正常对照组，从饲养即日起，每天予0.9%氯化钠注射液2 ml灌胃，并予普通大鼠饲料饲养。
2.3标本采集实验结束时从股动脉放血处死全部动物，血液以半径5 cm，1500 r/min离心10 min，分离血清，置于-80℃低温冰箱保存。迅速切取大鼠肝脏标本置于冰氯化钠溶液中充分洗涤，取右叶相同的部分以10%甲醛溶液固定，3 d内石蜡包埋备组织病理检测。剩余肝脏修剪成5 mm×3 mm×2 mm大小，其余部分肝脏-80℃低温冰箱保存。
2.4肝脏指数计算肝脏指数计算=肝脏湿重/体重×100%。
2.5肝组织病理检测肝组织石蜡包埋、切片、HE染色由贵阳医学院病理科完成，根据病理切片中组织增生程度，按半定量分级法分为0～Ⅵ级。0级：肝组织正常，无胶原纤维增生；Ⅰ级：胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸；Ⅱ级：胶原纤维延伸明显，但未相互连接包绕整个肝小叶；Ⅲ级：胶原纤维延伸明显，相互连接，包绕整个肝小叶；Ⅳ级：胶原纤维包绕、分割肝小叶，以至正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大、方形假小叶为主；v级：肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大、方形假小叶与小圆形假小叶约各占50%；Ⅵ级：肝内布满小圆形假小叶，纤维间隔粗大增生。 2.6检测血清ALT、AST的活性采用Siemens Advia 1650全自动生化分析仪按试剂盒要求测定ALT、AST的活性。
2.7 Real-time-PCR检测4TGF β1、TIMP1、MMP2 mR_NA在肝组织中的表达
采用Triz01提取鼠肝组织总RNA，纯化柱纯化，用紫外分光光度法测定RNA的量，A260/A280鉴定RNA纯度。分别取1000 ng总RNA，经MMLV逆转录酶催化合成cDNA第一链，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得出各样本的初始拷贝数。实验过程中以Beta-actin看家基因作为实时荧光RT-PCR的质控。每组样本一式2份，在指数期内，设定参数值，得到每个PCR反应的循环域（cycletkeshold，Ct）值，既模板cDNA经PCR扩增后达到某一荧光强度的循环次数。以每例标本组织的目的片段与带内参片段的Ct比值作为该标本基因表达的相对数值，以对照组的表达量为100%，计算各预防组的表达量。
所用引物序列如下：件分析。计量资料呈正态分布，以x±S表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组见均数多重比较用LSD-t检验。各组资料经方差齐性检验（Levene检验）方差齐。等级资料用Kruskal-Wallis秩和检验，组间资料多重比较用Wilcoxon秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3.结果与分析
3.1各组大鼠肝脏指数及ALT、AST结果
模型组大鼠血清AST、ALT均较生理盐水对照组大鼠明显升高（P值<0.05）；蓝莓汁预防组、丹芍化纤胶囊预防组及蓝莓 丹芍化纤胶囊预防组大鼠血清AST、ALT较模型组明显下降（P值<0.05）。见表1。
3.2各组大鼠肝纤维化程度
生理盐水对照组肝小叶结构完整，肝细胞大小，形态相似，排列规则，小叶内无细胞变性，无炎性细胞浸润；模型组可见多数肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性较多，汇管区及肝小叶内有较多炎性细胞浸润，肝小叶结构破坏，明显纤维间隔形成；各预防组：肝纤维化程度减轻（P<0.05）。见表2及图1。
A.生理盐水对照组为正常肝组织；B.模型组明显肝纤维化；C-E分别显示.蓝莓汁预防组、丹芍化纤胶囊预防组、.蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组，肝纤维化程度比模型组减轻。
3.3各组大鼠TGF-B 1和TIMP-1、MMP-2mRNA表达的比较
与生理盐水对照组比较，模型组肝组织内TGF-B 1和TIMP-1，MMP-2mRNA的表达均增加，P<0.05；与模型组比较，各预防组TGF-B1、TIMP-1mRNA的表达明显低于模型组（P<0.05），而MMP-2mRNA的表达高于模型组（P<0.05），各预防组之间无统计学差别。见表3。
★与丹芍化纤胶囊预防组比较p<0.05
讨论
肝纤维化的形成是胶原合成与降解失衡的结果，如果基质的沉积占优势，则向肝纤维化方向发展；如果基质降解过程增强，则肝纤维化可逆转，恢复。在肝组织内，参与细胞外基质（ECM）降解的主要是基质金属蛋白酶（MMPs）和特异性抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs），肝星状细胞（HSC）是产生MMP-2的主要细胞，HSC活化产生MMP-2，后者降解正常内皮下基质，又促进HSC活化，激活的HSC分泌TIMP-1和TIMP-2，抑制MMPs的功能，从而抑制胶原的降解，促进肝纤维化的进展。肝纤维化的进程中，MMPs与TIMPs调控机制的异常是胶原过多形成的原因。目前，在肝内共发现了8种基质金属蛋白酶，其中间质胶原蛋白酶（MMP-1），能够降解纤维化肝脏中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原，减少细胞外基质的沉积，对抑制肝纤维化的发生发展有重要作用。TIMP-1是体内MMP-1的特异抑制剂，它能通过其N-末端特异性地与MMP-1催化活性中心的锌离子结合，从而封闭期催化活性，使有活性的MMP-1失活。大量研究表明，TIMP-1的表达在肝纤维化过程中逐渐增强，到肝硬化阶段达到高峰。因此，随着肝纤维化的发展，TIMP-1进行性升高，使TIMP-1活性下降，造成肝损伤后肝脏内增生的ECM降解减少而过度沉积在肝内。有研究表明，在纤维化形成过程中，TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原表达依次升高。进一步研究TGF β1抑制MMP基因表达的机制，在兔MMP—1基因上游-249 bp、鼠MMP-3基因上游-709 bp处鉴定发现了一个TGF-β1抑制性反应元件（TIE）。在分子水平的研究，进一步证实TGF-β1对MMP及TIMP调节作用机理及其在纤维化性病变中的作用。TGF-β1改变了基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂（TIMP）的性。
蓝莓被誉为“第一号抗氧化剂”、“黄金浆果”，本课题组研究表明：蓝莓通过抗脂质过氧化作用对CC14所致大鼠急性肝损伤有保护作用；可激活小鼠肝脏的Nrf2及HO-1和NqOl的表达，提高T细胞的免疫功能，通过诱导金属硫蛋白（MT）的表达对CC14所致的大鼠肝纤维化有一定的预防作用。因此，我们通过检测肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β和MMP-2、TIMP-1mRNA表达变化，进一步探讨蓝莓预防肝纤维化作用机制。丹参、赤芍、汉防己、银杏等组成的中药复方制剂（丹芍化纤胶囊）是我们课题组根据中医活血化淤、通络软坚弹沦及多年临床探索研制而成的，大量的实验及临床研究中已经显示出有良好防治肝纤维化作用，其抗纤维化机制可能与抑制HSC增殖等有关，故本研究用丹芍化纤胶囊作为阳性对照。
在实验过程中观察到：蓝莓汁预防组，丹芍化纤胶囊预防组及蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组均能明显降低肝组织中ALT、AST的含量，改善肝功能，使肝组织病理程度减轻。在大鼠实验性肝纤维化模型组中，大鼠的肝组织呈现明显的胶原纤维沉积，与生理盐水组相比，模型组肝组织中TGF-β1、TIMP1表InRNA达水平显著增加，与模型组组相比，预防组肝组织中TGF-β1和TIMP1的含量明显降低。与正常组相比，模型组与各干预组MMP2mRNA的表达均增高，以各干预组增高更为明显。有报道在肝纤维化早期MMP-2在肝组织中的表达增加。MMP-2主要降解Ⅵ、Ⅴ型胶原和弹性硬蛋白（elastin）、纤维连接蛋白（fibronectin）及变性的工、Ⅲ型胶原，而Ⅳ型胶原是构成基底膜的主要成分。因此蓝莓预防肝纤维化的机制可能是通过抑制TGF β-1，TIMP-1的表达，以致其抑制MMP-2的能力减弱，从而提高MMP-2的活性，促进细胞外基质的降解，逆转肝纤维化的发展。
目的 观察蓝莓对大鼠肝纤维化肝组织TGF-B1和MMP-2、TIMP-1mRNA表达的影响，探讨蓝莓对大鼠肝纤维化的预防保护作用机制。
方法 SD大鼠随机分为生理盐水对照组（A），模型组（B），蓝莓汁预防组（C），丹芍化纤胶囊预防组（D），蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组（E），用四氯化碳（CC14）复合因素复制大鼠肝纤维化模型，共8周。测定各组大鼠血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性；并进行肝组织病理学检查；采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测TGF β1和MMP-2、TIMP-2mRNA的表达
结果 与B组比较，各预防组血清ALT及AST均明显降低（P<0.05）。与A组比较，B组TGF B 1、TIMP1的表达增加（P<0.05），MMP2的表达减少（P<0.05）。与B组比较，各预防组的TGF β1、TIMP1的表达均减少（P<0.05），而MMP2的表达增加（P<0.05）。
结论 蓝莓对CC14所致大鼠肝纤维化具有一定的预防保护作用，其机制可能与蓝莓抑制TGF-β1及TIMP-1分子的表达，增加MMP-2的表达有关。
关键词：蓝莓；肝纤维化；TGF-β1；MMP-2：TIMP-1
肝纤维化（hepatic fibrosis）是机体对慢性肝损伤的一种修复反应，是慢性肝病的共有病理变化。肝纤维化的实质是细胞外基质（extracellularMatrix，ECM）合成与降解失衡，导致ECM在肝内过度沉积所致。在肝内ECM降解中起关键作用的是基质金属蛋白酶（Matrix Mettalloproteinases，MMPs）和天然抑制物金属蛋白组织抑制剂（Tissue inhibitor of Mettalloproteinases，TIMPs）。TIMPs可特异性结合活化型的MMPs，导致后者功能失活。通过动物实验和临床研究，目前已认识到MMPs和TIMPs在肝纤维化中发挥着重要作用。
蓝莓属杜鹃花科越桔属，因其富含花青素、多酚类和黄酮类等生物活性物质，具有较强的抗氧化作用。本课题组的前期研究结果显示，蓝莓对四氯化碳（CC14）所致的大鼠急性肝损伤和大鼠肝纤维化有一定的预防作用。本研究旨在观察蓝莓对大鼠肝纤维化组织中TGF β1和MMP2、TIMP1表达的影响，进一步探讨蓝莓预防肝纤维化作用机制。
1.材料
1.1实验动物 雄性SD大鼠清洁级，体重220±20g，由贵阳医学院动物实验室提供。批号：SCXK（黔）2002-0001。
1.2主要药品与试剂 蓝莓（兔眼品种），由贵州省麻江县蓝莓生产基地提供，7月份采摘，-20℃保存，临用时解冻榨汁，2g干果约榨1ml蓝莓汁。丹芍化纤胶囊，胶囊由贵阳制药厂生产（批号：20081011）。TGF-β1、TIMP1、MMP2引物用Primer Express Soft Ware设计，委托上海捷瑞生物有限公司合成。β-actin引物由美国国家环境卫生科学研究所刘杰博士惠赠。CC14由成都金山化学试剂有限公司生产（批号：070410），胆固醇由北京化学试剂公司生产（批号：060801），SYBRGreen试剂盒由美国Applied Biosystems公司生产（批号：10804104），RNA纯化试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产（批号：#H6820），反转录试剂盒由加拿大Fermentas MBI公司生产（批号：00033699），Trizol由美国Invitrogen公司生产（批号：382739），DEPC、磷酸盐缓冲液（PBs液）、枸橼酸盐缓冲液均由武汉博士德生物工程有限公司（批号：AR0044、AR0030、AK0024）。
2.方法
2.1分组 45只雄性SD大鼠随机分为5组：生理盐水对照组（A组）、模型组（B组）、蓝莓汁预防组（C组）、丹芍化纤胶囊预防组（D组）、蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组（E组），每组各9只。
2.2模型复制除正常对照组外，其他4组用复合病因刺激制备肝纤维化模型。模型制备首剂为0.4 ml/100g CC14皮下注射，CC14浓度为40%，按2：3比例与花生油配制，每隔4 d注射1次，以后剂量为0.3 ml/100g，同时给予高脂饮食（79.5%玉米粉、20%猪油、0.5%胆固醇），共8周。同期，蓝莓汁预防组用蓝莓汁（1.5 ml//100g）每天灌胃1次。丹芍化纤胶囊预防组用丹芍化纤胶囊（0.1 g/100g）每天灌胃1次。蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组用蓝莓汁（1.5ml//100g） 丹芍化纤胶囊（0.1g/100g）每天灌胃1次。正常对照组，从饲养即日起，每天予0.9%氯化钠注射液2 ml灌胃，并予普通大鼠饲料饲养。
2.3标本采集实验结束时从股动脉放血处死全部动物，血液以半径5 cm，1500 r/min离心10 min，分离血清，置于-80℃低温冰箱保存。迅速切取大鼠肝脏标本置于冰氯化钠溶液中充分洗涤，取右叶相同的部分以10%甲醛溶液固定，3 d内石蜡包埋备组织病理检测。剩余肝脏修剪成5 mm×3 mm×2 mm大小，其余部分肝脏-80℃低温冰箱保存。
2.4肝脏指数计算肝脏指数计算=肝脏湿重/体重×100%。
2.5肝组织病理检测肝组织石蜡包埋、切片、HE染色由贵阳医学院病理科完成，根据病理切片中组织增生程度，按半定量分级法分为0～Ⅵ级。0级：肝组织正常，无胶原纤维增生；Ⅰ级：胶原纤维从汇管区或中央静脉周围轻度向外延伸；Ⅱ级：胶原纤维延伸明显，但未相互连接包绕整个肝小叶；Ⅲ级：胶原纤维延伸明显，相互连接，包绕整个肝小叶；Ⅳ级：胶原纤维包绕、分割肝小叶，以至正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大、方形假小叶为主；v级：肝小叶结构完全破坏，假小叶形成，大、方形假小叶与小圆形假小叶约各占50%；Ⅵ级：肝内布满小圆形假小叶，纤维间隔粗大增生。 2.6检测血清ALT、AST的活性采用Siemens Advia 1650全自动生化分析仪按试剂盒要求测定ALT、AST的活性。
2.7 Real-time-PCR检测4TGF β1、TIMP1、MMP2 mR_NA在肝组织中的表达
采用Triz01提取鼠肝组织总RNA，纯化柱纯化，用紫外分光光度法测定RNA的量，A260/A280鉴定RNA纯度。分别取1000 ng总RNA，经MMLV逆转录酶催化合成cDNA第一链，以此为模板进行实时荧光定量PCR扩增，得出各样本的初始拷贝数。实验过程中以Beta-actin看家基因作为实时荧光RT-PCR的质控。每组样本一式2份，在指数期内，设定参数值，得到每个PCR反应的循环域（cycletkeshold，Ct）值，既模板cDNA经PCR扩增后达到某一荧光强度的循环次数。以每例标本组织的目的片段与带内参片段的Ct比值作为该标本基因表达的相对数值，以对照组的表达量为100%，计算各预防组的表达量。
所用引物序列如下：件分析。计量资料呈正态分布，以x±S表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组见均数多重比较用LSD-t检验。各组资料经方差齐性检验（Levene检验）方差齐。等级资料用Kruskal-Wallis秩和检验，组间资料多重比较用Wilcoxon秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3.结果与分析
3.1各组大鼠肝脏指数及ALT、AST结果
模型组大鼠血清AST、ALT均较生理盐水对照组大鼠明显升高（P值<0.05）；蓝莓汁预防组、丹芍化纤胶囊预防组及蓝莓 丹芍化纤胶囊预防组大鼠血清AST、ALT较模型组明显下降（P值<0.05）。见表1。
3.2各组大鼠肝纤维化程度
生理盐水对照组肝小叶结构完整，肝细胞大小，形态相似，排列规则，小叶内无细胞变性，无炎性细胞浸润；模型组可见多数肝小叶结构紊乱，肝细胞脂肪变性较多，汇管区及肝小叶内有较多炎性细胞浸润，肝小叶结构破坏，明显纤维间隔形成；各预防组：肝纤维化程度减轻（P<0.05）。见表2及图1。
A.生理盐水对照组为正常肝组织；B.模型组明显肝纤维化；C-E分别显示.蓝莓汁预防组、丹芍化纤胶囊预防组、.蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组，肝纤维化程度比模型组减轻。
3.3各组大鼠TGF-B 1和TIMP-1、MMP-2mRNA表达的比较
与生理盐水对照组比较，模型组肝组织内TGF-B 1和TIMP-1，MMP-2mRNA的表达均增加，P<0.05；与模型组比较，各预防组TGF-B1、TIMP-1mRNA的表达明显低于模型组（P<0.05），而MMP-2mRNA的表达高于模型组（P<0.05），各预防组之间无统计学差别。见表3。
★与丹芍化纤胶囊预防组比较p<0.05
讨论
肝纤维化的形成是胶原合成与降解失衡的结果，如果基质的沉积占优势，则向肝纤维化方向发展；如果基质降解过程增强，则肝纤维化可逆转，恢复。在肝组织内，参与细胞外基质（ECM）降解的主要是基质金属蛋白酶（MMPs）和特异性抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs），肝星状细胞（HSC）是产生MMP-2的主要细胞，HSC活化产生MMP-2，后者降解正常内皮下基质，又促进HSC活化，激活的HSC分泌TIMP-1和TIMP-2，抑制MMPs的功能，从而抑制胶原的降解，促进肝纤维化的进展。肝纤维化的进程中，MMPs与TIMPs调控机制的异常是胶原过多形成的原因。目前，在肝内共发现了8种基质金属蛋白酶，其中间质胶原蛋白酶（MMP-1），能够降解纤维化肝脏中ECM的主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原，减少细胞外基质的沉积，对抑制肝纤维化的发生发展有重要作用。TIMP-1是体内MMP-1的特异抑制剂，它能通过其N-末端特异性地与MMP-1催化活性中心的锌离子结合，从而封闭期催化活性，使有活性的MMP-1失活。大量研究表明，TIMP-1的表达在肝纤维化过程中逐渐增强，到肝硬化阶段达到高峰。因此，随着肝纤维化的发展，TIMP-1进行性升高，使TIMP-1活性下降，造成肝损伤后肝脏内增生的ECM降解减少而过度沉积在肝内。有研究表明，在纤维化形成过程中，TGF-β1、TIMP1、Ⅰ型胶原表达依次升高。进一步研究TGF β1抑制MMP基因表达的机制，在兔MMP—1基因上游-249 bp、鼠MMP-3基因上游-709 bp处鉴定发现了一个TGF-β1抑制性反应元件（TIE）。在分子水平的研究，进一步证实TGF-β1对MMP及TIMP调节作用机理及其在纤维化性病变中的作用。TGF-β1改变了基质金属蛋白酶（MMP）及其抑制剂（TIMP）的性。
蓝莓被誉为“第一号抗氧化剂”、“黄金浆果”，本课题组研究表明：蓝莓通过抗脂质过氧化作用对CC14所致大鼠急性肝损伤有保护作用；可激活小鼠肝脏的Nrf2及HO-1和NqOl的表达，提高T细胞的免疫功能，通过诱导金属硫蛋白（MT）的表达对CC14所致的大鼠肝纤维化有一定的预防作用。因此，我们通过检测肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β和MMP-2、TIMP-1mRNA表达变化，进一步探讨蓝莓预防肝纤维化作用机制。丹参、赤芍、汉防己、银杏等组成的中药复方制剂（丹芍化纤胶囊）是我们课题组根据中医活血化淤、通络软坚弹沦及多年临床探索研制而成的，大量的实验及临床研究中已经显示出有良好防治肝纤维化作用，其抗纤维化机制可能与抑制HSC增殖等有关，故本研究用丹芍化纤胶囊作为阳性对照。
在实验过程中观察到：蓝莓汁预防组，丹芍化纤胶囊预防组及蓝莓汁 丹芍化纤胶囊预防组均能明显降低肝组织中ALT、AST的含量，改善肝功能，使肝组织病理程度减轻。在大鼠实验性肝纤维化模型组中，大鼠的肝组织呈现明显的胶原纤维沉积，与生理盐水组相比，模型组肝组织中TGF-β1、TIMP1表InRNA达水平显著增加，与模型组组相比，预防组肝组织中TGF-β1和TIMP1的含量明显降低。与正常组相比，模型组与各干预组MMP2mRNA的表达均增高，以各干预组增高更为明显。有报道在肝纤维化早期MMP-2在肝组织中的表达增加。MMP-2主要降解Ⅵ、Ⅴ型胶原和弹性硬蛋白（elastin）、纤维连接蛋白（fibronectin）及变性的工、Ⅲ型胶原，而Ⅳ型胶原是构成基底膜的主要成分。因此蓝莓预防肝纤维化的机制可能是通过抑制TGF β-1，TIMP-1的表达，以致其抑制MMP-2的能力减弱，从而提高MMP-2的活性，促进细胞外基质的降解，逆转肝纤维化的发展。